亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        核內(nèi)RNA對(duì)真核細(xì)胞基因組三維高級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

        2021-01-05 08:40:18金加沈文龍李平張彥陳昭烈趙志虎
        生物技術(shù)通訊 2020年5期
        關(guān)鍵詞:熱圖染色質(zhì)文庫(kù)

        金加,沈文龍,李平,張彥,陳昭烈,趙志虎

        軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所,北京 100071

        細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)在三維空間上的精確折疊包裝和選擇性表達(dá)決定了細(xì)胞的命運(yùn),也為各種染色體活動(dòng)(如轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[1-3])的正常進(jìn)行提供了保障。一維線性染色質(zhì)通過(guò)螺旋纏繞和高度折疊最終形成更高級(jí)的拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域(topologically associating domains,TAD)和A/B區(qū)室。A區(qū)室主要富集H3K4ac、H3K4me1等活躍的組蛋白修飾標(biāo)志,存在高密度的基因分布和復(fù)制起始位點(diǎn);相反B區(qū)室富含H3K27me3等沉默的組蛋白修飾標(biāo)志,分布的基因較少,另外還有晚期復(fù)制區(qū)域[2-4]。然而這些結(jié)構(gòu)并不是一成不變的,在分化或疾病發(fā)生時(shí)也可能會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化[5-6]。

        Isoda等研究發(fā)現(xiàn)核內(nèi)RNA參與了區(qū)室和環(huán)(loop)的形成[7-8],并且Erdel發(fā)現(xiàn)核內(nèi)RNA可以通過(guò)“液相分離”[9]來(lái)創(chuàng)建局部細(xì)胞核環(huán)境,從而促進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)無(wú)膜細(xì)胞器的組裝,進(jìn)而形成更高度有序的核結(jié)構(gòu),比如核糖體RNA介導(dǎo)的核結(jié)構(gòu)的形成[10-11]。據(jù)報(bào)道,核內(nèi)RNA不僅可以參與形成完整的區(qū)室[12-15],還參與形成其他核結(jié)構(gòu)域,如剪接因子富集斑點(diǎn)、核仁等[16-19]。如果將核內(nèi)RNA去除,通過(guò)電子顯微鏡進(jìn)行顯色觀察發(fā)現(xiàn)高度有序的核結(jié)構(gòu)發(fā)生混亂[14,20],所以核內(nèi)RNA在核結(jié)構(gòu)的形成中扮演重要的角色。

        為了探究核內(nèi)RNA對(duì)染色體三維高級(jí)結(jié)構(gòu)的影響,我們用全基因組染色質(zhì)構(gòu)象捕獲(highthroughput/resolution chromosome conformation capture,Hi-C)技術(shù)分析了野生型GM12878細(xì)胞和經(jīng)RNase處理的GM12878細(xì)胞染色質(zhì)的相互作用,以及A/B區(qū)室和拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域的變化。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        女性B淋巴細(xì)胞GM12878由本室保存。GM12878細(xì)胞存在特殊的X染色體失活現(xiàn)象,是研究核內(nèi)RNA對(duì)染色體三維結(jié)構(gòu)影響的很好的實(shí)驗(yàn)?zāi)P?。GM12878細(xì)胞已經(jīng)參與了許多組學(xué)研究,可為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供參考且便于培養(yǎng)。

        RPMI培養(yǎng)基(Hyclone公司);多聚甲醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);RNaseA(50 U/mL)、RNaseT1(20 000 U/mL)、Pro Flex PCR System(Life Technologies公司);RNaseH(5000 U/mL)、HindⅢ-HF(100 U/μL)(NEB公司);T4DNA連接酶(5 Weiss U/μL)(Thermo Scientific公司);超聲破碎儀(VCX-750 SONICS)。

        1.2 GM12878細(xì)胞的Hi-C實(shí)驗(yàn)

        采用Hi-C技術(shù),分別對(duì)野生型GM12878細(xì)胞和經(jīng)RNase處理的GM12878細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先將約6×107GM12878細(xì)胞于4℃、500 r/min離心5 min,用2 mL 1×PBS洗滌1次,用4 mL 1×PBS重懸細(xì)胞沉淀,將細(xì)胞混勻后移入50 mL離心管,在其中加入40 μL 10%甲醛溶液,使其終濃度為1%,在搖床上交聯(lián)10 min,加入終濃度為0.125 mol/L的甘氨酸,混勻后在搖床上終止交聯(lián)5 min,4℃、500 r/min離心5 min,棄上清,用裂解液重懸細(xì)胞沉淀后在冰上靜置5 min,再將裂解液移入Dounce管,輕輕上下轉(zhuǎn)動(dòng)管內(nèi)的磨砂玻璃棒20次,然后將野生GM12878細(xì)胞Dounce管中的裂解液直接用5 μLHindⅢ酶切,RNase處理組Dounce管中的裂解液在5 μLHindⅢ酶切的同時(shí)加入 5.2 μL RNaseH、13 μL RNaseA/RNaseT1,4℃、500 r/min離心5 min,棄上清,用2 μL KLenow、2.4 μL 10mmol/L dA/T/GTP、2.4 μL 5 mmol/L生物素標(biāo)記的dCTP、5 μL緩沖液2和39 μL ddH2O補(bǔ)平粘性末端,吹打混勻,在旋轉(zhuǎn)混勻儀上于23℃混勻4 h,補(bǔ)平體系,500 r/min離心3 min,棄上清,加入215 μL ddH2O、25 μL T4DNA連接酶緩沖液洗滌1次,用10 μL T4DNA連接酶于16℃連接8 h,然后用蛋白酶K解交聯(lián),超聲打斷后,進(jìn)行建庫(kù)二代測(cè)序。

        1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

        首先將得到的Hi-C數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控,分別進(jìn)行文庫(kù)過(guò)濾統(tǒng)計(jì)、文庫(kù)比對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和文庫(kù)有效數(shù)據(jù)過(guò)濾統(tǒng)計(jì),在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),分別繪制全基因組相互作用熱圖、全基因組相互作用衰減指數(shù)(interaction decay exponents,IDE)比較分析、差異熱圖比較分析、統(tǒng)計(jì)A、B區(qū)室差異并采用GO注釋進(jìn)行功能分析。此外,對(duì)染色體之間的相互作用(秩和檢驗(yàn)P<0.05)和TAD邊界強(qiáng)度進(jìn)行比較分析(Vilcox檢驗(yàn)P<0.05)。

        2 結(jié)果

        2.1 Hi-C數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制

        在文庫(kù)過(guò)濾統(tǒng)計(jì)中(圖1A),野生型GM12878末端完全配對(duì)片段占比97.92%,經(jīng)RNase處理的GM12878末端完全配對(duì)片段占比98.43%,2組文庫(kù)的完全配對(duì)片段占比較高。文庫(kù)比對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(圖1B),與參考文庫(kù)相比,野生型GM12878文庫(kù)惟一配對(duì)片段占比74.65%,經(jīng)RNase處理的GM12878文庫(kù)惟一配對(duì)片段占比73.52%,沒(méi)有配對(duì)的其他類型片段占比較低,2組文庫(kù)樣本質(zhì)量較好。2組文庫(kù)有效數(shù)據(jù)過(guò)濾統(tǒng)計(jì)(圖1C),野生型GM12878文庫(kù)相互作用片段占比95.45%,其中有效相互作用片段占比82.09%,在RNase處理的GM12878文庫(kù)中,相互作用占比95.09%,其中有效相互作用74.1%,表明Hi-C實(shí)驗(yàn)質(zhì)量較高。

        2.2 核內(nèi)RNA對(duì)染色體相互作用的影響

        野生型GM12878染色體內(nèi)相互作用熱圖(圖2A)和RNase處理后的GM12878染色體相互作用熱圖(圖2B)中的橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)代表同一染色體的不同堿基位置,圖中的紅點(diǎn)代表了染色體兩位置之間存在較強(qiáng)的相互作用,紅色越強(qiáng)表示相互作用的強(qiáng)度越大。野生型GM12878和RNase處理的GM12878染色體內(nèi)部的相互作用呈現(xiàn)出一樣的相互作用狀態(tài),都是區(qū)室內(nèi)部的相互作用大于區(qū)室之間的相互作用。

        圖1 Hi-C數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制

        為了比較野生型GM12878和RNase處理的GM12878染色體內(nèi)部的相互作用差異,將野生型GM12878染色體內(nèi)相互作用減扣RNase處理的GM12878染色體內(nèi)相互作用。圖3橫縱坐標(biāo)分別代表同一染色體上的不同位置,圖內(nèi)紅點(diǎn)代表野生型GM12878相互作用更強(qiáng),藍(lán)點(diǎn)代表RNase處理的GM12878相互作用更強(qiáng)。相比于近距離的染色質(zhì)內(nèi)相互作用,染色體內(nèi)遠(yuǎn)距離的相互作用有更多的改變。這也表明核內(nèi)RNA在遠(yuǎn)距離的相互作用上起到了更重要的作用。

        我們繪制了全基因組IDE曲線(圖4),隨著基因距離的不斷增大,野生型GM12878和RNase處理的GM12878細(xì)胞的相互作用頻率由10-6下降到10-8,其中RNase處理組在基因距離108堿基對(duì)處的相互作用頻率略高于野生型GM12878,說(shuō)明相比于野生型GM12878細(xì)胞,經(jīng)RNase處理后的GM12878細(xì)胞的染色體遠(yuǎn)距離相互作用有所增強(qiáng),染色體的結(jié)構(gòu)變得松散。

        圖2 X染色質(zhì)相互作用熱圖

        圖3 染色質(zhì)內(nèi)相互作用的減扣

        圖4 染色質(zhì)相互作用衰減指數(shù)

        除此之外,我們還比較了2組細(xì)胞的染色體之間的相互作用(圖5),RNase處理的GM12878細(xì)胞染色體間相互作用分?jǐn)?shù)高于野生型GM12878細(xì)胞(秩和檢驗(yàn)P<0.05)。這也說(shuō)明經(jīng)過(guò)RNase處理的GM12878細(xì)胞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散。

        2.3 核內(nèi)RNA對(duì)A/B區(qū)室的影響

        為了進(jìn)一步分析核內(nèi)RNA對(duì)區(qū)室的影響,我們統(tǒng)計(jì)了2組GM1287細(xì)胞在A/B區(qū)室上的變化。所有染色體A/B區(qū)室轉(zhuǎn)變比例餅圖(圖6A)中,A區(qū)室轉(zhuǎn)變?yōu)锽區(qū)室占比0.51%,B區(qū)室轉(zhuǎn)變?yōu)锳區(qū)室占比0.62%,未發(fā)生變化的A區(qū)室占比48.38%,未發(fā)生改變的B區(qū)室占比50.48%。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn),B區(qū)室轉(zhuǎn)變?yōu)锳區(qū)室所占比例高于A區(qū)室轉(zhuǎn)變?yōu)锽區(qū)室。將發(fā)生轉(zhuǎn)變區(qū)室上的基因進(jìn)行GO注釋功能分析,發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)變區(qū)塊中,A區(qū)室轉(zhuǎn)變成B區(qū)室上的基因在功能上主要和脫氫酶相關(guān),B區(qū)室轉(zhuǎn)變成A區(qū)室上的基因在功能上主要和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分相關(guān)。在X染色體A/B區(qū)室轉(zhuǎn)變比例餅圖(圖6B)中,A區(qū)室轉(zhuǎn)變?yōu)锽區(qū)室占比1.45%,B區(qū)室轉(zhuǎn)變?yōu)锳區(qū)室占比1.45%,未發(fā)生變化的A區(qū)室占比47.98%,未發(fā)生改變的B區(qū)室占比49.12%,所以相比于所有染色體的變化,X染色體上發(fā)生變化的A/B區(qū)室的比例更高。由于GM12878是女性淋巴細(xì)胞,含有2條X染色體,其中一條由于核內(nèi)非編碼RNA Xist的緊密纏繞而處于壓縮狀態(tài),我們認(rèn)為RNase的處理導(dǎo)致緊密的X染色體變得松散,所以相比于所有染色體A/B區(qū)室的變化,X染色體的A/B區(qū)室變化更大。對(duì)編碼Xist基因的74M左右區(qū)域進(jìn)行染色體相互作用分析(圖7),野生型GM12878細(xì)胞Xist基因位置的相互作用減扣RNase處理的GM12878細(xì)胞Xist位置的相互作用顯示藍(lán)色增多,說(shuō)明相比于野生型GM12878細(xì)胞,RNase處理后GM12878細(xì)胞的相互作用更弱。

        圖5 染色質(zhì)之間的相互作用比較(*P<0.05)

        圖6 A/B區(qū)室轉(zhuǎn)變比例

        2.4 核內(nèi)RNA對(duì)TAD邊界強(qiáng)度的影響

        為了觀察RNase處理后TAD邊界強(qiáng)弱的變化,將野生型GM12878和RNase處理的GM12878細(xì)胞的TAD邊界的強(qiáng)弱進(jìn)行比較(圖8),發(fā)現(xiàn)相比于野生型GM12878細(xì)胞,經(jīng)RNase處理的GM12878細(xì)胞的TAD邊界強(qiáng)度較?。╒ilcox校驗(yàn)P<0.05)。這是因?yàn)橛捎诤藘?nèi)RNA參與了loop形成,經(jīng)RNase處理,導(dǎo)致環(huán)結(jié)構(gòu)改變,進(jìn)而影響TAD結(jié)構(gòu)變得松散,從而減弱了TAD邊界強(qiáng)度。

        3 結(jié)論

        圖7 X染色體74M左右區(qū)域相互作用熱圖

        圖8 TAD邊界強(qiáng)弱變化

        我們證實(shí)了核內(nèi)RNA對(duì)真核細(xì)胞染色體三維高級(jí)結(jié)構(gòu)是有影響的,RNA的去除導(dǎo)致真核細(xì)胞染色體三維高級(jí)結(jié)構(gòu)在整體上變得松散,A/B區(qū)室發(fā)生改變,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RNA可以通過(guò)結(jié)合RNA結(jié)合蛋白對(duì)染色質(zhì)進(jìn)行修飾,進(jìn)而調(diào)控染色質(zhì)環(huán)的形成,核內(nèi)RNA還參與了TAD邊界的形成和建立,而RNase處理導(dǎo)致了環(huán)結(jié)構(gòu)的破壞,TAD邊界強(qiáng)度減弱?;蚪M染色體三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是表觀遺傳的關(guān)鍵,受到許多物質(zhì)的調(diào)控,如核內(nèi)RNA、蛋白質(zhì)、激素等。如果基因組的三維結(jié)構(gòu)或者調(diào)控出現(xiàn)了偏差,有可能導(dǎo)致疾病。我們認(rèn)為在未來(lái)會(huì)研發(fā)出一些更好的分子生物實(shí)驗(yàn),特別是研究核內(nèi)RNA對(duì)染色質(zhì)三維高級(jí)結(jié)構(gòu)和染色質(zhì)修飾物影響的實(shí)驗(yàn),這對(duì)于揭示基因組三維高級(jí)結(jié)構(gòu)形成的潛在原理至關(guān)重要。

        猜你喜歡
        熱圖染色質(zhì)文庫(kù)
        染色質(zhì)開(kāi)放性與動(dòng)物胚胎發(fā)育關(guān)系的研究進(jìn)展
        哺乳動(dòng)物合子基因組激活過(guò)程中的染色質(zhì)重塑
        專家文庫(kù)
        優(yōu)秀傳統(tǒng)文化啟蒙文庫(kù)
        幽默大師(2020年10期)2020-11-10 09:07:22
        關(guān)于推薦《當(dāng)代詩(shī)壇百家文庫(kù)》入選詩(shī)家的啟事
        染色質(zhì)可接近性在前列腺癌研究中的作用
        “哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞生發(fā)泡染色質(zhì)構(gòu)型的研究進(jìn)展”一文附圖
        專家文庫(kù)
        熱圖
        攝影之友(2016年12期)2017-02-27 14:13:20
        熱圖
        大奶白浆视频在线观看| 国产精品自线在线播放| 国产一品二品三品精品久久| 91精品国产综合久久久密臀九色 | 亚洲国产中文字幕一区| 精品国产一区二区三区三| 在线播放真实国产乱子伦 | 国产a级三级三级三级| 亚洲乱码国产一区三区| 国产黑色丝袜在线观看视频| 免费看片的网站国产亚洲| 丰满少妇人妻久久精品| 国产性生交xxxxx无码| 亚洲色无码播放| 91热爆在线精品| 久久精品亚洲94久久精品| 亚洲av无码av在线播放| 国内精品久久久久久久久久影院| 亚洲综合色婷婷七月丁香| 黄色国产一区二区99| 国产女人高潮叫床免费视频| 精品第一页| 92自拍视频爽啪在线观看| 四虎成人精品在永久免费| 国模丽丽啪啪一区二区| 欧美成人中文字幕| 人妻少妇激情久久综合| 五月色婷婷丁香无码三级| 9 9久热re在线精品视频| 在线视频这里只有精品| 亚洲女同同性少妇熟女| 日本a级一级淫片免费观看| 最近在线更新8中文字幕免费 | 国产在线精品福利大全| 99精品人妻少妇一区二区三区| 一本大道道久久综合av| 东北妇女肥胖bbwbbwbbw| 精品国产一区二区三区亚洲人| 91色综合久久熟女系列| 欧美狠狠入鲁的视频777色| av鲁丝一区鲁丝二区|