孫克娜，許小雨，朱小雙，宋御繁，劉曉斐

1.濰坊醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，山東濰坊 261053；2.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六〇醫(yī)院 檢驗(yàn)科，山東濟(jì)南 250031；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 檢驗(yàn)科，黑龍江 哈爾濱 150000

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的首位，嚴(yán)重威脅婦女健康及生命安全[1-2]。隨著疫苗接種和篩查的普及，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率在發(fā)達(dá)國家顯著降低，而在發(fā)展中國家仍處于較高水平，占全球患病總?cè)藬?shù)的85%以上[3]。目前細(xì)胞學(xué)檢查與人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）DNA檢測(cè)是我國宮頸癌主要的篩查手段，但女性月經(jīng)經(jīng)期會(huì)延誤取材時(shí)間[4]，特異性較低，假陰性率可達(dá)40%[5]，臨床應(yīng)用受到限制。鱗狀細(xì)胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCCA）、癌抗原CA-125和CA-153等血清學(xué)標(biāo)志物已被廣泛用于臨床，但在早期患者中升高并不明顯[6-7]，會(huì)造成部分患者的漏診。宮頸癌的療效取決于臨床分期[8]，早期患者經(jīng)及時(shí)手術(shù)治療后生存率較高，甚至可以完全治愈。中晚期患者以同步放化療為主要治療方式，半數(shù)以上患者死于局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[9]。因此，早期診斷是提高患者生存率和生活質(zhì)量的關(guān)鍵。

蛋白質(zhì)組學(xué)的概念最早由Wilkins[10]提出，是對(duì)細(xì)胞整體水平蛋白質(zhì)屬性的研究（表達(dá)水平、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯后加工、相互作用等），在蛋白質(zhì)水平上獲得關(guān)于疾病發(fā)生、細(xì)胞代謝等過程整體而全面的認(rèn)識(shí)。研究表明，弱陽離子交換磁珠（magnetic bead-weak cation exchange，WCX-MB）對(duì)低豐度蛋白質(zhì)具有較好的富集能力[11]，與蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術(shù)聯(lián)合可用于腫瘤相關(guān)蛋白的檢測(cè)和鑒定[12]，從而為研究疾病的發(fā)病機(jī)制、尋找腫瘤標(biāo)志物和藥物治療靶點(diǎn)提供線索。我們應(yīng)用MALDI-TOF MS技術(shù)聯(lián)合WCX-MB對(duì)宮頸癌患者組與健康組血清蛋白質(zhì)圖譜的變化進(jìn)行對(duì)比分析，篩選出血清差異表達(dá)蛋白/多肽，建立宮頸癌診斷預(yù)測(cè)模型并納入子宮良性病變組進(jìn)行驗(yàn)證，尋找可用于診斷宮頸癌的潛在標(biāo)志物，旨在提高宮頸癌早期診斷水平，改善患者預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六〇醫(yī)院2019年7月至2020年1月確診的34例宮頸癌患者血清標(biāo)本作為癌癥組，年齡53.53±13.17歲，中位年齡51.5歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①未經(jīng)過手術(shù)、放化療及抗癌藥物治療；②經(jīng)病理組織學(xué)確診；③具有完整的臨床資料；④在收集血清前1個(gè)月患者未接受過輸血。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有其他惡性腫瘤；②患有免疫系統(tǒng)疾病及傳染性疾?。虎鄹文I功能不全。選取同期來院做健康查體的各項(xiàng)指標(biāo)均正常且無既往史的女健康人群26例作為健康組，年齡55.78±11.69歲，中位年齡53歲。2組年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。收集27例子宮良性病變（息肉、增厚）患者血清用于后續(xù)模型驗(yàn)證，與癌癥組年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此前瞻性試驗(yàn)方案獲第九六〇醫(yī)院科研倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 材料

Autoflex Speed MALDI-TOF-MS、FlexControl軟件、ClinPro Tools軟件、MTP An-chorip 384 BC靶板、WCX-MB試劑盒、蛋白多肽標(biāo)準(zhǔn)品（Bruker公司）；低溫高速離心機(jī)（Eppendorf公司）；磁珠分離器（LiferTechnologies公司）；α-氰基-4羥基肉桂酸（HCCA）、三氟乙酸（TFA）、乙腈（ACN）、色譜級(jí)無水乙醇、丙酮（Sigma-Aldrich公司）。

1.3 標(biāo)本采集和預(yù)處理

采集初診宮頸癌患者、子宮良性病變患者和健康者空腹靜脈血5 mL置于含惰性分離膠的真空采血管中，避免標(biāo)本溶血。室溫靜置30 min，3000 r/min離心5 min，將分離的血清樣品分裝在0.5 mL EP管中，-80℃冰箱儲(chǔ)存，避免標(biāo)本反復(fù)凍融。處理和儲(chǔ)存步驟均在抽血后3 h內(nèi)完成。

1.4 WCX-MB提取提取血清蛋白質(zhì)/肽

從-80℃冰箱中取出收集的血清，在-20℃冰箱中解凍8 h，再于4℃冰箱中直至血清全融，低溫高速離心機(jī)9848 r/min離心5 min，取上清。以下操作均于冰上進(jìn)行。0.5 mL EP管中分別加入10 μL結(jié)合緩沖液（BB）和 10 μL WCX-MB，用微量移液器上下吸打混勻；將5 μL離心后的血清加入EP管，混勻，靜置5 min；將EP管放于磁珠分離器上分離磁珠1 min，棄上清；加入100 μL洗滌緩沖液（WB），于磁珠分離器上將前后相鄰兩樣品管交換移動(dòng)，反復(fù)10次，靜置1 min，棄上清，然后重復(fù)洗滌步驟2次，最后一次應(yīng)完全去除上清液；加入5 μL洗脫緩沖液（EB），混勻，避免產(chǎn)生氣泡，磁珠分離器上靜置2 min；取上清于新的0.5 mL EP管中，加入5 μL穩(wěn)定緩沖液（SB），混勻后用于質(zhì)譜分析。

1.5 儀器校準(zhǔn)與質(zhì)量控制

用制備好的蛋白質(zhì)/多肽標(biāo)準(zhǔn)品混合液校準(zhǔn)儀器，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。隨機(jī)選取20例體檢健康者，各取5 μL血清混勻，制成質(zhì)量控制標(biāo)本，用于評(píng)估質(zhì)譜儀檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性。通過磁珠提取混合血清中的蛋白/多肽，檢測(cè)時(shí)每15個(gè)樣本點(diǎn)1次靶，得到4個(gè)質(zhì)控樣本質(zhì)譜圖，選取4個(gè)穩(wěn)定質(zhì)譜峰，各個(gè)多肽峰的變異系數(shù)（CV）平均值為16.94%（12.32%～20.61%），說明本試驗(yàn)方法重復(fù)穩(wěn)定性較好。

1.6 質(zhì)譜檢測(cè)樣本

取1 μL蛋白質(zhì)/多肽樣本點(diǎn)樣于Anchor-Chip 384 BC靶板上，自然干燥，每份樣本點(diǎn)靶3次，評(píng)估方法的穩(wěn)定性；將1 μL基質(zhì)（50%乙腈和2%三氟乙酸配制的3 mg/mL的HCCA）點(diǎn)樣于已干燥的樣本點(diǎn)上，室溫干燥后上機(jī)檢測(cè)，采集質(zhì)譜圖并分析。參數(shù)設(shè)置：采用陽離子線性模式，在相對(duì)分子質(zhì)量1000～15 000范圍內(nèi)采集數(shù)據(jù)，激光強(qiáng)度70%，每個(gè)樣品點(diǎn)累積轟擊100×20次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有樣本采用盲法檢測(cè)和分析。用FlexControl軟件采集數(shù)據(jù)，標(biāo)準(zhǔn)參照為相對(duì)分子質(zhì)量1000～10 000的多肽和蛋白混合物。用ClinPro Tools 3.0軟件處理數(shù)據(jù)（基線去除、平滑、歸一化），選取信噪比≥5的多肽峰做統(tǒng)計(jì)分析。將癌癥組和健康組樣本按3∶1隨機(jī)分組，訓(xùn)練組44例（宮頸癌患者25例、健康者19例），驗(yàn)證組16例（宮頸癌患者9例、健康者7例）。分別采用遺傳算法（genetic algorithm，GA）、監(jiān)督神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（supervised neural network，SNN）算法和快速分類（quick classification，QC）算法等3種方法建立模型，并于驗(yàn)證組驗(yàn)證模型的敏感性、特異性及準(zhǔn)確性，選擇最佳診斷預(yù)測(cè)模型。應(yīng)用良性對(duì)照組對(duì)最佳診斷模型進(jìn)行進(jìn)一步效能驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 血清差異蛋白/多肽分析

為了初步了解宮頸癌患者與健康組的血清蛋白/多肽平均質(zhì)譜圖之間的差異，采用FlexControl 3.4和ClinPro Tools 3.0軟件對(duì)癌癥組和健康組的圖譜進(jìn)行分析，相對(duì)分子質(zhì)量范圍為1000～10 000，發(fā)現(xiàn)2組間蛋白/多肽指紋圖譜存在明顯差異（圖1），共找到差異多肽峰114個(gè)，其中61個(gè)具有顯著性差異（P＜0.05），且有12個(gè)多肽峰ROC曲線下面積大于0.70（表1）。選取多肽峰差異最顯著的m/z 4210.90和4645.11做疊加質(zhì)譜圖及ROC曲線分析，2個(gè)峰的AUC值分別為0.97、0.85（圖2），其三維峰堆疊譜圖見圖3。

2.2 診斷預(yù)測(cè)模型的建立及驗(yàn)證

圖1 癌癥組和健康組的血清蛋白質(zhì)/肽指紋圖譜

用ClinPro Tools 3.0軟件分析2組質(zhì)譜圖，應(yīng)用宮頸癌患者和健康者的訓(xùn)練組（44例）對(duì)3種不同算法分別建立模型，并于驗(yàn)證組（16例）進(jìn)行外部驗(yàn)證。交叉驗(yàn)證的主要思想是將數(shù)據(jù)分成兩部分，一部分用于模型的訓(xùn)練，另一部分用于對(duì)訓(xùn)練好的模型進(jìn)行預(yù)測(cè)誤差估計(jì)，客觀判斷這些參數(shù)對(duì)訓(xùn)練集之外數(shù)據(jù)的符合程度[13]。識(shí)別能力是判斷數(shù)據(jù)性質(zhì)、價(jià)值和水平的能力。通過綜合分析3種模型的交叉驗(yàn)證和識(shí)別能力，發(fā)現(xiàn)QC模型的診斷表現(xiàn)最佳（表2）。隨后通過盲樣驗(yàn)證QC模型，在該模型9例宮頸癌患者中的8例被正確識(shí)別，1例被排除；7例健康體檢者均被正確分類。其診斷準(zhǔn)確性為93.75%，特異性為100%，敏感性為88.89%。以差異最顯著的2個(gè)峰m/z 4210.90和4645.11分別為x、y軸對(duì)訓(xùn)練組血清樣本做聚類分析，結(jié)果顯示癌癥組和健康組間樣本基本無交叉，可被顯著區(qū)分（圖4）。

表1 癌癥組與健康組的差異蛋白/多肽

圖2 疊加譜峰圖與ROC曲線

2.3 QC模型性能驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證QC模型的診斷效能，對(duì)良性病變患者和癌癥患者的驗(yàn)證組（17例）進(jìn)行盲樣驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，QC模型中9例宮頸癌患者均被正確分類；8例良性對(duì)照患者有6例被正確識(shí)別，2例被排除。其診斷準(zhǔn)確性為88.24%，特異性為75%，敏感性為100%。以差異最顯著的2個(gè)峰m/z 4210.84和1779.84分別為x、y軸對(duì)訓(xùn)練組（44例）血清樣本做聚類分析，結(jié)果顯示宮頸癌患者組和良性對(duì)照組間樣本基本無交叉，可被顯著區(qū)分（圖5）。由此可見，QC模型對(duì)于宮頸癌患者的診斷具有充分可行性。

表2 3種診斷預(yù)測(cè)模型的診斷表現(xiàn)

3 討論

圖3 三維堆疊譜圖

圖4 癌癥組和健康組的聚類分析

圖5 癌癥組和良性對(duì)照組的聚類分析

MALDI-TOF MS是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展的新技術(shù)，因高準(zhǔn)確度、高靈敏度和高通量等優(yōu)點(diǎn)，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用越來越廣泛[14]。傳統(tǒng)的二維凝膠電泳（2D-PAGE）技術(shù)操作復(fù)雜，重復(fù)穩(wěn)定性差，對(duì)小分子、低豐度蛋白質(zhì)的分離效果較差[15]。而WCX-MB對(duì)血清中低豐度蛋白/多肽的富集能力強(qiáng)[16]，可消除大分子多肽的干擾，具有簡單快速和高敏感性等優(yōu)點(diǎn)，已成為研究蛋白質(zhì)組學(xué)的強(qiáng)有力方法。此外，該方法只需要5 μL血清即可快速獲得患者的血清蛋白圖譜，無須多次測(cè)量，可節(jié)約醫(yī)療資源，幫助臨床醫(yī)生及時(shí)做出診斷，減輕患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

目前，WCX-MB聯(lián)合MALDI-TOF MS技術(shù)在胃癌[17]、非小細(xì)胞肺癌[18]和食管癌[19]等多種惡性腫瘤中已廣泛應(yīng)用，具有充分的可行性。在宮頸癌中也發(fā)現(xiàn)了具有早期診斷價(jià)值的蛋白，如載脂蛋白CⅡ[20]等。但目前尚未發(fā)現(xiàn)可用于臨床宮頸癌診斷的特異血清標(biāo)志物，分析其原因可能在于癌癥患者的異質(zhì)性、質(zhì)譜技術(shù)的靈敏性和特異性、缺乏有效的驗(yàn)證策略[21]。在本研究中，我們采用同樣方法，篩選出12個(gè)具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的多肽峰，其中m/z 4210.90和4645.11的差異最顯著，二者的AUC值分別為0.97和0.85，有望成為診斷宮頸癌的潛在腫瘤標(biāo)志物。分別建立GA、SNN和QC算法診斷預(yù)測(cè)模型，經(jīng)過綜合比較分析，發(fā)現(xiàn)QC算法對(duì)癌癥組和健康組的診斷準(zhǔn)確性為93.75%，特異性為100%，敏感性為88.89%，該模型效能最佳。為了進(jìn)一步驗(yàn)證QC模型的診斷效能，我們對(duì)癌癥組和良性對(duì)照組進(jìn)行外部盲樣驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其對(duì)癌癥組和良性對(duì)照組的診斷準(zhǔn)確性為88.24%，特異性為75%，敏感性為100%。Ziqi等[22]對(duì)3985例宮頸癌患者進(jìn)行Meta分析，發(fā)現(xiàn)SCCA診斷的敏感性為0.70，特異性為0.63，AUC值為0.73。由此可見，本研究建立的QC模型具有較高的診斷敏感性和特異性，提示該模型可用于宮頸癌輔助診斷的進(jìn)一步研究。

Chen等[23]采用同樣方法對(duì)宮頸癌患者血清進(jìn)行分析，但結(jié)果與本試驗(yàn)中獲得的峰大有不同，只有m/z 1998.48與本試驗(yàn)中m/z 1998.75的質(zhì)譜峰大致相同。分析其原因，可能在于本研究標(biāo)本量來源于單中心，可能存在選擇偏倚。后續(xù)我們將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，對(duì)各年齡、各民族進(jìn)行充分驗(yàn)證。此外，本研究所篩選出的差異多肽/蛋白質(zhì)譜峰，有待于對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜鑒定和ELISA驗(yàn)證。

綜上所述，本研究建立的宮頸癌QC算法診斷預(yù)測(cè)模型具有較高的診斷效能，可用于宮頸癌高危人群的篩查及輔助診斷。m/z 4210.90和4645.11可能是潛在的宮頸癌標(biāo)志物，有待于進(jìn)一步地鑒定和分析。