劉悅

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046）

關(guān)鍵字：周期阻滯；凋亡通路；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；端粒酶

0 引言

細(xì)胞凋亡是在一些生理或者輕微病理因素刺激下，活體組織中的單個(gè)細(xì)胞主動(dòng)死亡的過程。表現(xiàn)為細(xì)胞固縮，染色質(zhì)邊集，細(xì)胞膜可出芽形成凋亡小體，凋亡小體被吞噬細(xì)胞或其他細(xì)胞吞噬[1]。現(xiàn)在研究表明，惡性腫瘤的產(chǎn)生與凋亡異常密切相關(guān)，一旦細(xì)胞周期監(jiān)控失控，DNA受損的細(xì)胞將不能正常修復(fù)和凋亡，將繼續(xù)分裂，結(jié)果基因突變數(shù)量增加，往往導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生癌變[2]。目前很多化療藥物都是通過誘導(dǎo)凋亡抗腫瘤的，如依賴P53，F(xiàn)as/FasL,Bcl-2介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[3]?？鄥A是中藥苦參的提取物，屬于生物堿類，近年來作為抗腫瘤藥受到廣泛關(guān)注，對(duì)肝癌，肺癌，乳腺癌等惡性腫瘤都有一定的抑制作用，主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用的。BH3-only蛋白模擬物，Bcl-2拮抗劑，bax激活劑這些合成的單靶點(diǎn)藥物，雖然能明顯調(diào)控某個(gè)蛋白表達(dá)，但是臨床試驗(yàn)卻效果不佳，提示細(xì)胞有自身代償。而中國特有的中醫(yī)藥或者它的單體是多靶點(diǎn)的，多方面的，或許可以更好的應(yīng)用于臨床?？鄥A可以通過誘導(dǎo)周期阻滯，調(diào)控信號(hào)通路，抑制端粒酶促進(jìn)凋亡，還可以通過調(diào)控免疫反應(yīng)，抑制腫瘤遷徙和轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤血管生成發(fā)揮作用。

1 周期阻滯與細(xì)胞凋亡

細(xì)胞周期會(huì)受到嚴(yán)密的調(diào)控來保障細(xì)胞正常的分裂增殖，p53/p21信號(hào)通路是細(xì)胞核心調(diào)控途徑，p53調(diào)控p21表達(dá)，P21通過結(jié)合抑制CDK2（細(xì)胞周期素依賴性激酶）/CyclinE(細(xì)胞周期蛋白)和CDK4/CyclinD復(fù)合物,阻斷RB(視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)基因)基因磷酸化，去磷酸化的RB與E2F結(jié)合，使E2F無法調(diào)控下游基因表達(dá)[4]，細(xì)胞G1期阻滯。P53也可以誘導(dǎo)G2期阻滯，但不是必需的。細(xì)胞周期阻滯會(huì)使細(xì)胞修復(fù)，修復(fù)失敗就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。很多惡性腫瘤都會(huì)出現(xiàn)P53突變，恢復(fù)P53的活性，成為腫瘤治療的熱門之一。馬建秀等[5]通過研究苦參堿聯(lián)合奧利沙鉑對(duì)結(jié)腸癌SW620作用時(shí)發(fā)現(xiàn)苦參堿可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞阻滯于G2/M期，而且具有增強(qiáng)奧利沙鉑誘導(dǎo)P53表達(dá)增加的作用。李磊等[6]通過研究氧化苦參堿對(duì)胃癌SGC-7901作用時(shí)發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿可以使細(xì)胞P21表達(dá)增加，隨著時(shí)間越長，P21表達(dá)越明顯。而且氧化苦參堿可以使細(xì)胞阻滯于G0/G1期，隨著藥物濃度增加對(duì)G0/G1阻滯作用更強(qiáng)。肖旭等[7]在研究苦參堿對(duì)乳腺癌Bcap-37作用時(shí)發(fā)現(xiàn)苦參堿可以上調(diào)P53下調(diào)CyclinD1,C-myc蛋白表達(dá)，CyclinD1是P53下游基因，CyclinD1和C-myc主要調(diào)控G1/S期，說明苦參堿通過下調(diào)CyclinD1,C-myc蛋白影響G1期向S期轉(zhuǎn)換。耿婭等[8]發(fā)現(xiàn)低濃度苦參堿誘導(dǎo)肝細(xì)胞L-02阻滯G0/G1期，而高濃度苦參堿使細(xì)胞G2/M期阻滯，S期延長?？鄥A對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控，主要通過一些關(guān)鍵蛋白實(shí)現(xiàn)的，這些蛋白既可以作用于下游的周期蛋白影響細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換，從而誘導(dǎo)周期阻滯，又可以作用于凋亡通路蛋白，使細(xì)胞發(fā)生凋亡?？鄥A把腫瘤細(xì)胞阻滯于哪一期，跟腫瘤細(xì)胞的類別和苦參堿的濃度有關(guān)。

2 凋亡通路與凋亡

凋亡通路分為內(nèi)源性線粒體通路，死亡受體通路和內(nèi)源性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路，其中線粒體通路是中心調(diào)控階段。Bcl-2家族凋亡中抑制凋亡的蛋白如Bcl-2，Bcl-xl，Bcl-W等，促進(jìn)凋亡的蛋白如Bax，Bak，BH3-only蛋白(Bid,Bad,Bim)也屬于促凋亡蛋白[9]。

2.1 線粒體凋亡通路與凋亡

線粒體凋亡通路是細(xì)胞凋亡最經(jīng)典的途徑，在內(nèi)源性損傷因素（如藥物干擾下，激素缺乏），BH3-only蛋白激活增多，使bax變構(gòu)定位于MOM(線粒體外膜)上，BH3-only蛋白不以這樣方式作用于bak，因?yàn)閎ak直接定位于MOM上，BH3-only蛋白也可以使定位在MOM上的bax/bak暴露出BH3位點(diǎn)，形成bax/bak二聚體，寡聚體[10]，孔道開放，線粒體膜間隙中的Cytc進(jìn)入胞漿與Apaf-1（凋亡蛋白酶活化因子），Pro-caspase-9，ATP結(jié)合，形成凋亡復(fù)合體，自我剪切激活Pro-caspase-9形成caspase-9，caspase-9剪切激活下游caspase-3，激活的caspase-3激活下游蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。

人類許多腫瘤都存在抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的過度表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞生長加速，不易凋亡，最后惡性程度增加。抗凋亡蛋白可以使bax從MOM轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，避免bax在MOM寡聚，有人認(rèn)為是Bcl-xL通過Bax的持續(xù)轉(zhuǎn)移維持細(xì)胞質(zhì)中的Bax[12]?？沟蛲龅鞍自龆噙€可以與促凋亡蛋白如形成Bax/Bcl-2異源二聚體，抑制bak/bax同源二聚體形成來抑制凋亡?？沟蛲龅鞍自龆嗫赡芘cBH3-only蛋白結(jié)合，阻止BH3-only蛋白對(duì)bax/bak的激活[13]BH3-only蛋白模擬物作為新型抗腫瘤藥物，與腫瘤細(xì)胞過表達(dá)的Bcl-2蛋白結(jié)合，來阻止Bcl-2蛋白與bax/bak結(jié)合，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。既往研究表明，苦參堿可以通過調(diào)節(jié)凋亡蛋白來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。劉桐等[14]在研究苦參堿對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡作用時(shí)發(fā)現(xiàn)苦參堿可以使細(xì)胞Bax表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)降低。程向東等[15]在研究苦參堿對(duì)肝癌Hep G2細(xì)胞凋亡作用中發(fā)現(xiàn)苦參堿可以降低Bcl-2蛋白的表達(dá)，提高Bax蛋白的表達(dá)，而且可以促進(jìn)Bax從胞漿向線粒體移位，降解激活caspase-3，9蛋白說明苦參堿有可能通過激活內(nèi)源性線粒體通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

2.2 Fas/FasL通路與凋亡

在外源性通路中，最經(jīng)典的是Fas/FasL通路，F(xiàn)as/FasL結(jié)合導(dǎo)致Fas胞內(nèi)部形成活化三聚體，隨后募集FADD（Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白）與Pro-caspase-8形成DISC（死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體）。Pro-caspase-8自我剪切被激活形成caspase-8，caspase-8不但可以剪切激活caspase-3,6,7，而且可以啟動(dòng)線粒體凋亡途徑[16]。黃光弦等[17]在研究苦參堿對(duì)小鼠S180肉瘤細(xì)胞凋亡作用時(shí)發(fā)現(xiàn)苦參堿可以上調(diào)瘤體組織Fas/FasL表達(dá)，增加caspase-8的表達(dá)和活性，說明苦參堿可能通過啟動(dòng)Fas/FasL通路促進(jìn)凋亡。

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路與凋亡

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔出現(xiàn)未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白積聚或者滯留時(shí)，如損傷因素刺激或者泛素蛋白酶體被抑制，會(huì)觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激時(shí)Bip與PERK解離，PERK自身活化使eIF-2磷酸化，增加ATF4的表達(dá)，ATF4通過上調(diào)CHOP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。目前蛋白酶體抑制劑可能通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。Junli[19]等在研究苦參堿通過激活（未折疊蛋白反應(yīng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路）UPR/ER抑制前列腺癌中發(fā)現(xiàn)苦參堿可以抑制蛋白酶體，使前列腺癌Bip表達(dá)增加，eIF2a磷酸化增加，CHOP和ATF4表達(dá)增加，而且可以抑制Bcl-2蛋白促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞凋亡，說明苦參堿很有可能通過激活UPR/ER通路促凋亡的。苦參堿還可以時(shí)間依賴性抑制CyclinD1，CyclinB1，C-myc，CDK1的表達(dá)，導(dǎo)致G0/G1期發(fā)生周期阻滯，也有可能通過激活UPR/ER通路實(shí)現(xiàn)的。曹珊等[20]在研究苦參素對(duì)食管癌Eca-109細(xì)胞凋亡作用時(shí)發(fā)現(xiàn)苦參素可以上調(diào)CHOPmRNA,下調(diào)BIPmRNA，說明苦參素可能通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路，通過上調(diào)CHOP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡通路是由很多蛋白質(zhì)參與的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，這些蛋白質(zhì)的表達(dá)處在一種動(dòng)態(tài)平衡中，隨著細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)的變化而變化，當(dāng)發(fā)生腫瘤時(shí)，這些蛋白表達(dá)會(huì)失衡，比如抗凋亡蛋白表達(dá)增加，這些蛋白作用下游蛋白產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)有可能會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分裂增殖。調(diào)控這些蛋白的表達(dá)也許可以抑制增殖或者誘導(dǎo)凋亡，從而治療腫瘤，但是這些蛋白作用機(jī)制過于復(fù)雜，針對(duì)某種蛋白的靶向藥有可能通過旁路代償，并沒有很好的效果，所以尋找合適的靶點(diǎn)至關(guān)重要。中醫(yī)藥或者它的單體是多靶點(diǎn)的，或許可以通過研究苦參堿作用機(jī)制尋找敏感的新靶點(diǎn)，或者尋找某些有效的中藥單體或者單體聯(lián)合靶向藥可以達(dá)到治療腫瘤的效果。

3 端粒酶與凋亡

端粒位于真核細(xì)胞染色體末端，由高度重復(fù)的DNA序列和端粒結(jié)合蛋白組成的，類似帽子結(jié)構(gòu)，具有保護(hù)DNA不被降解的功能。染色體每復(fù)制一次，端粒縮短一截，一旦端粒過短，持續(xù)的DNA損傷應(yīng)答就會(huì)造成p53信號(hào)通路被激活，細(xì)胞停止分裂或者啟動(dòng)凋亡。端粒酶由RNA和蛋白質(zhì)組成的逆轉(zhuǎn)錄酶，可以使端粒不會(huì)隨著分裂而變短。正常人體細(xì)胞幾乎檢測不到端粒酶活性，所以端粒會(huì)隨著分裂變短，大部分腫瘤細(xì)胞端粒比正常細(xì)胞短，端粒酶活性卻增強(qiáng)，這與腫瘤細(xì)胞不衰老，無限增殖有關(guān)，提示人們可以通過抑制端粒酶活性而抑制端粒延長達(dá)到抗腫瘤的效果[21]。現(xiàn)在這類靶向分子藥很難應(yīng)用于臨床，因?yàn)閷?duì)人體有很大不良反應(yīng)，在作用用于腫瘤的同時(shí)也會(huì)作用于一些端粒酶活性高的細(xì)胞，比如說成體干細(xì)胞，苦參堿具有副作用小的優(yōu)點(diǎn)。張璐燁[22]等研究表明苦參堿可以誘導(dǎo)RB（視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤）細(xì)胞凋亡，而且可以減弱RB細(xì)胞端粒酶活性。李海軍[23]等研究表明苦參堿對(duì)人乳腺癌MCF-7有明顯的促凋亡作用，而且端粒酶的活性隨苦參堿的濃度和作用時(shí)間增加而下降。說明苦參堿有可能通過抑制端粒酶的活性來發(fā)揮促進(jìn)凋亡作用的。

4 結(jié)語

苦參堿作用機(jī)制極其復(fù)雜，誘導(dǎo)不同腫瘤細(xì)胞凋亡的主要激活通路也不都相同，本文主要從三個(gè)方面介紹苦參堿對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，在此基礎(chǔ)上研究苦參堿的其他作用機(jī)制，開發(fā)其他藥用價(jià)值，或者與一些分子靶向藥聯(lián)合應(yīng)用，將為臨床疑難雜癥的治療打開新天地。