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        黃野螟化學(xué)感受基因的鑒定與分析

        2021-01-04 22:04:45李資聰劉磊楊斌嚴(yán)善春王桂榮
        植物保護(hù) 2021年6期
        關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序

        李資聰 劉磊 楊斌 嚴(yán)善春 王桂榮

        摘要 :昆蟲(chóng)的化學(xué)感受系統(tǒng)在昆蟲(chóng)的取食、交配等多種行為中發(fā)揮著重要作用。黃野螟Heortia vitessoides是一種寡食性害蟲(chóng),幼蟲(chóng)具有聚集性、暴食性等特點(diǎn),對(duì)土沉香Aquilaria sinensis危害嚴(yán)重。本研究使用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)黃野螟成蟲(chóng)觸角和口器的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序,共鑒定到124個(gè)化學(xué)感受基因,包括50個(gè)氣味受體(odorant receptor,OR)基因,19個(gè)離子型受體(ionotropic receptor,IR)基因,17個(gè)味覺(jué)受體(gustatory receptor,GR)基因,19個(gè)氣味結(jié)合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因,17個(gè)化學(xué)感受蛋白(chemosensory protein,CSP)基因和2個(gè)感覺(jué)神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane protein,SNMP)基因。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化和差異表達(dá)分析,對(duì)黃野螟化學(xué)感受基因的分化,以及不同性別、不同組織間的表達(dá)差異進(jìn)行系統(tǒng)性的研究。以氣味受體為例,HvitOR42、HvitOR43和HvitOR48聚在傳統(tǒng)的性信息素受體(pheromone receptor,PR)分支,其中HvitOR42和HvitOR43在雄性成蟲(chóng)觸角中特異性高表達(dá),這3個(gè)氣味受體可能參與識(shí)別黃野螟雌性成蟲(chóng)釋放的性信息素。此外,HvitOR20在雌性成蟲(chóng)觸角中特異性高表達(dá),可能與雌性成蟲(chóng)交配和產(chǎn)卵等行為相關(guān)。本研究為進(jìn)一步探究黃野螟的化學(xué)感受機(jī)制提供了分子基礎(chǔ),為開(kāi)發(fā)以化學(xué)生態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的黃野螟綠色害蟲(chóng)防控技術(shù)提供了理論依據(jù)。

        關(guān)鍵詞 :黃野螟; 轉(zhuǎn)錄組; 高通量測(cè)序; 化學(xué)感受基因

        中圖分類號(hào):

        S 433.4

        文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A

        DOI: 10.16688/j.zwbh.2021151

        Identification and analysis of chemosensory genes in Heortia vitessoides

        LI Zicong1, LIU Lei1, YANG Bin2*, YAN Shanchun1*, WANG Guirong2

        (1.College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2.State Key

        Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection,

        Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

        Abstract

        Insect chemosensory system plays an important role in various behaviors such as feeding and mating.The yellow stem borer Heortia vitessoides is a kind of oligophagous pests against Aquilaria sinensis, causing serious damages by larval aggregation and overeating.In this study, high-throughput sequencing technology was used to obtain the transcriptomes in the antennae and mouthparts of H.vitessoides adults.As a result, 124 chemosensory genes were identified, including 50 odorant receptor (OR) genes, 19 ionotropic receptor (IR) genes, 17 gustatory receptor (GR) genes, 19 odorant binding protein (OBP) genes, 17 chemosensory protein (CSP) genes and two sensory neuron membrane protein (SNMP) genes.Phylogenetic and differential expression analyses were carried out to systematically study the gene differentiation and tissue specific expression of these chemosensory genes in H.vitessoides.Taking the odorant receptors as an example, HvitOR42, HvitOR43 and HvitOR48 clustered in the clade of traditional sex pheromone receptor, among which HvitOR42 and HvitOR43 were highly expressed in the male adult antennae, which were considered important in the recognition of sex pheromones produced by the females.In addition, HvitOR20 was highly expressed in the female antennae, which was considered to be involved in the female specific behaviors such as mating and oviposition.This study provided a molecular basis for further study of the chemosensory mechanism in H.vitessoides, and helps develop new methods for controlling H.vitessoides.

        Key words

        Heortia vitessoides; transcriptome; high-throughput sequencing; chemosensory genes

        昆蟲(chóng)包括嗅覺(jué)和味覺(jué)在內(nèi)的化學(xué)感受系統(tǒng)能識(shí)別環(huán)境中的各種化學(xué)物質(zhì),影響昆蟲(chóng)的取食、求偶、交配和躲避天敵等多種行為[12]。昆蟲(chóng)的外周化學(xué)感受神經(jīng)元是識(shí)別外部環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的主要神經(jīng)通路,包含嗅覺(jué)感受神經(jīng)元(olfactory receptor neuron,ORNs)和味覺(jué)感受神經(jīng)元(gustatory receptor neuron,GRN)[3]。嗅覺(jué)感受神經(jīng)元主要分布于昆蟲(chóng)的觸角,而味覺(jué)感受神經(jīng)元主要分布于喙。除此之外,化學(xué)感受神經(jīng)元也在下唇須、下顎須、足和翅等多個(gè)組織中分布[4]。在分子層面上,化學(xué)感受的過(guò)程主要由幾個(gè)功能上相互關(guān)聯(lián)的不同基因家族所介導(dǎo),包括氣味受體(odorant receptor,OR)、離子型受體(ionotropic receptors,IR)、味覺(jué)受體(gustatory receptor,GR)等3個(gè)受體蛋白家族和氣味結(jié)合蛋白(odorant binding protein,OBP)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory protein,CSP)、感覺(jué)神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane protein,SNMP)[510]等3個(gè)非受體蛋白家族。這些基因家族在昆蟲(chóng)化學(xué)感受過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用,可作為未來(lái)害蟲(chóng)防治的潛在靶標(biāo)。

        黃野螟Heortia vitessoides屬鱗翅目Lepidoptera螟蛾科Pyralidae,是典型的寡食性食葉害蟲(chóng),主要分布于我國(guó)熱帶和南亞熱帶氣候區(qū),其高度適生區(qū)集中在珠江流域和瀾滄江流域南部,未來(lái)適生區(qū)有向北擴(kuò)展的趨勢(shì)[11]。該蟲(chóng)僅取食沉香屬Aquilaria和漆樹(shù)屬Toxicodendron等的少數(shù)幾種植物,是我國(guó)土沉香Aquilaria sinensis的主要害蟲(chóng)[12]。土沉香是瑞香科Thymelaeceae沉香屬Aquilaria常綠喬木,為我國(guó)沉香的主要植物來(lái)源[13]。沉香是生產(chǎn)中藥、熏香和香水的重要原料,其在國(guó)際市場(chǎng)上價(jià)格堪比黃金。野生土沉香已被中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和國(guó)家林業(yè)和草原局列為國(guó)家瀕危三級(jí)保護(hù)植物、國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)野生保護(hù)植物[14]。因具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,土沉香人工種植面積不斷擴(kuò)大,病蟲(chóng)害問(wèn)題日益凸顯。黃野螟是我國(guó)土沉香種植區(qū)的重點(diǎn)防治對(duì)象,具有聚集性、暴食性等特點(diǎn),幼蟲(chóng)數(shù)日內(nèi)可將植株葉片取食一空,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致種植區(qū)內(nèi)90%以上植株大面積受損,嚴(yán)重影響土沉香的生長(zhǎng)[15]。目前,針對(duì)黃野螟的防治方法主要是化學(xué)防治[16],但化學(xué)防治專一性差,對(duì)非靶標(biāo)生物尤其是天敵資源危害較大。此外,化學(xué)農(nóng)藥的不合理使用會(huì)影響沉香的藥用及食用價(jià)值,導(dǎo)致一系列的食品安全問(wèn)題。利用昆蟲(chóng)性信息素防治害蟲(chóng),具有專一性強(qiáng)、對(duì)環(huán)境無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn),是綠色無(wú)公害的新型害蟲(chóng)防控方法。然而,針對(duì)黃野螟性信息素及其識(shí)別機(jī)制的研究較少,識(shí)別性信息素的化學(xué)感受基因也未知,亟需深入研究。

        本研究使用Illumina HiSeqTM 2000高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)黃野螟雌、雄成蟲(chóng)的觸角和口器進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,鑒定了黃野螟OR、IR、GR、OBP、CSP和SNMP 6個(gè)基因家族的化學(xué)感受基因,并通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化和差異表達(dá)基因(differential expression gene,DEG)分析,對(duì)黃野螟化學(xué)感受基因的分化,以及不同性別、不同組織間的表達(dá)差異情況進(jìn)行系統(tǒng)性研究。本研究旨在為開(kāi)發(fā)黃野螟的新型防治策略奠定理論基礎(chǔ),為從分子層面上以受體基因?yàn)榘袠?biāo)篩選和設(shè)計(jì)新型高效的引誘劑和交配干擾劑提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 供試?yán)ハx(chóng)

        黃野螟幼蟲(chóng)采自廣東省廣州市天河區(qū)火爐山森林公園(113°38′E,23°19′N),帶回實(shí)驗(yàn)室后在溫度(26±1)℃、濕度(65±5)%、光周期L∥D=15 h∥9 h的人工氣候箱中使用新鮮的土沉香葉片飼養(yǎng)。幼蟲(chóng)化蛹后,根據(jù)第8和第9腹節(jié)的形態(tài)差異,將雌、雄蟲(chóng)分別置于不同養(yǎng)蟲(chóng)籠,成蟲(chóng)羽化后飼喂10%蜂蜜水。選取3日齡未交配的雌、雄成蟲(chóng)各120頭進(jìn)行觸角和口器(喙、下顎須和下唇須)等組織的收集,取下的組織置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2 總RNA提取和文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

        采用TRIzol法分別提取黃野螟雌、雄成蟲(chóng)觸角和口器的RNA。使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。使用NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific,USA)檢測(cè)RNA的濃度和純度,使用Agilent 2100 (Agilent Technologies,USA)檢測(cè)RNA的完整性。取檢測(cè)合格的RNA樣品各1.5 μg,按照NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina(NEB,USA)的操作方法進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建,并使用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行檢查,檢查合格后使用Illumina HiSeqTM 2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

        1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的組裝與注釋

        測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)通過(guò)刪除接頭序列、含有較高比率未知堿基的序列、長(zhǎng)度過(guò)短的序列,最終得到clean reads。使用Trinity軟件對(duì)clean reads進(jìn)行組裝。將組裝獲得的unigene分別與非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(non-redundant protein sequence database,NR)、蛋白家族(protein family,PFAM)、SwissProt蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)(a manually annotated, non-redundant protein sequence database)、基因本體論(gene ontology database,GO)、直系同源基因簇(clusters of orthologous groups of proteins,KOG/COG)、直系同源蛋白分組比對(duì)(evolutionary genealogy of genes:non-supervised orthologous groups,EggNOG)和京都基因與基因組百科(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)等7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),獲得相應(yīng)的注釋信息。

        1.4 黃野螟化學(xué)感受相關(guān)基因的鑒定及基因表達(dá)量分析

        黃野螟化學(xué)感受基因的鑒定有兩種方法。第一,從NR、PFAM、SwissProt、GO、COG、KOG、EggNOG、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的結(jié)果中提取比對(duì)到的黃野螟化學(xué)感受基因序列。第二,從SilkDB 3.0(https:∥silkdb.bioinfotoolkits.net/)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載家蠶Bombyx mori的化學(xué)感受基因,使用本地BLAST(BLASTx、BLASTn、tBLASTn)查找這些基因在黃野螟中的同源序列(E value<1×10-2)。將上述得到的序列合并,使用NCBI在線數(shù)據(jù)庫(kù)再次驗(yàn)證,刪除錯(cuò)誤匹配或匹配度較低的序列,最終獲得每個(gè)基因家族的候選基因。使用ExPASy(expert protein analysis system)服務(wù)器(http:∥web.expasy.org/translate/)預(yù)測(cè)所有候選基因的ORF,并分別與其他物種的同源基因比對(duì)確認(rèn)序列是否為全長(zhǎng)。使用TMHMM 2.0預(yù)測(cè)候選基因的跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain,TMD)。計(jì)算所有候選基因的FPKM(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)值,比較候選基因在黃野螟成蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)情況[17]。

        1.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

        從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中下載不同物種的化學(xué)感受基因用來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),包括家蠶、棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera、亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis、稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis、桃蛀螟Conogethes punctiferalis、煙青蟲(chóng)Helicoverpa assulta和黑腹果蠅Drosophila melanogaster。通過(guò)MAFFT(https:∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/)進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。使用RAxML 8.0通過(guò)最大似然法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)使用Jones-Taylor-Thornton氨基酸替代模型(JTT),快速hill-climbing算法(-fd),進(jìn)行1 000次bootstrap統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè),對(duì)最佳的樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在似然值對(duì)數(shù)上設(shè)置模型最佳的精確度(-e),使用默認(rèn)值0.01。最終選取最優(yōu)結(jié)果并使用Fig Tree v 1.4.0軟件進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)的編輯。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 黃野螟觸角、口器轉(zhuǎn)錄組的組裝和注釋

        利用Illumina HiSeqTM 2000平臺(tái)對(duì)黃野螟雌、雄成蟲(chóng)觸角和口器共4個(gè)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,最終得到29.03 Gb,包含97 063 932條clean reads的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。各個(gè)樣品總堿基數(shù)均達(dá)到6.37 Gb以上,測(cè)序質(zhì)量分值為Q20和Q30時(shí),質(zhì)量合格的reads比例分別高于97.15%和92.38%,GC含量在45.08%~46.20%(表1)。將4個(gè)樣品的測(cè)序結(jié)果合并進(jìn)行組裝,共獲得109 943條轉(zhuǎn)錄本和43 058條unigenes,N50長(zhǎng)度分別為3 372 bp和2 086 bp,平均長(zhǎng)度分別為1 936.34 bp和1 168.64 bp,具體結(jié)果見(jiàn)表2。使用不同的數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)unigene進(jìn)行了注釋,獲得了4 360~15 044條注釋結(jié)果,其中NR數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到的unigene數(shù)量最多,占總基因數(shù)量的34.94%(表3)。

        2.2 氣味受體家族基因的鑒定及分析

        通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序總共鑒定到50個(gè)OR基因,命名為HvitOR1~HvitOR50,GenBank登錄號(hào)為MW717297~MW717346(表4)。其中,獲得全長(zhǎng)序列的OR基因有31個(gè),氨基酸序列長(zhǎng)度為370~474 aa,跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain, TMD)的數(shù)量為4~7個(gè)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明(圖1),黃野螟的氣味受體在進(jìn)化樹(shù)各個(gè)分支中均有分布。其中,HvitOR2為氣味受體共受體(olfactory receptor co-receptor,ORco),HvitOR42、HvitOR43、HvitOR48為性信息素受體(pheromone receptor,PR)。DEG結(jié)果表明,性信息素受體HvitOR42和HvitOR43在雄性觸角中均為高表達(dá)(表達(dá)量大于雌性10倍以上),但HvitOR48在雌、雄觸角中的表達(dá)量差異不大。此外,HvitOR20在雌性觸角中高表達(dá)(表達(dá)量大于雄性10倍以上)。HvitOR2、HvitOR8、HvitoR14、HvitOR15、HvitOR18、HvitOR19、HvitOR22、HvitOR26、HvitOR28、HvitOR30、HvitOR32、HvitOR33、HvitOR40、HvitOR41、HvitOR45和HvitOR46在雄性口器中高表達(dá)(表達(dá)量大于雌性10倍以上)(表4)。

        2.3 離子型受體家族基因的鑒定及分析

        本研究共鑒定到19個(gè)IR基因,GenBank 登錄號(hào)為MW717347~MW717364,其中HvitIR25a由于序列長(zhǎng)度過(guò)短未上傳(表5)。有7個(gè)IR基因獲得了全長(zhǎng)序列,氨基酸序列長(zhǎng)度在548 aa(HvitIR76b)到912 aa(HvitIR8a)之間,TMD結(jié)構(gòu)數(shù)量為3~4個(gè)。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明,黃野螟的19個(gè)IR分別聚在4個(gè)IR分支上(圖2)。DEG結(jié)果表明,觸角中HvitIR8a和HvitIR25a的表達(dá)量高于其他IR。此外,HvitIR2、HvitIR8a、HvitIR21a、HvitIR75p1、HvitIR87a和HvitIR93a均在雄性口器中高表達(dá)(表達(dá)量大于雌性10倍以上)(表5)。值得注意的是,黃野螟的HvitIR41a出現(xiàn)了特異性序列分化,且HvitIR41a.2的表達(dá)量高于HvitIR41a.1。

        2.4 味覺(jué)受體家族基因的鑒定及分析

        通過(guò)對(duì)黃野螟觸角與口器的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,鑒定到了17個(gè)GR,將其命名為HvitGR1~HvitGR17,GenBank登錄號(hào)為MW717365~MW717381(表6)。然而,只有1個(gè)GR(HvitGR3)獲得了全長(zhǎng),氨基酸長(zhǎng)度為476 aa。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明(圖3),HvitGR1、HvitGR2、HvitGR3與家蠶、棉鈴蟲(chóng)和煙青蟲(chóng)的二氧化碳受體聚為一支。HvitGR4~HvitGR8聚在糖受體分支,HvitGR9~HvitGR12聚在果糖受體分支, HvitGR13~HvitGR16聚在苦味受體分支。DEG結(jié)果表明,GR的表達(dá)量普遍較低,其中果糖受體HvitGR10在觸角中表達(dá)含量最高,而二氧化碳受體HvitGR1~HvitGR3在口器中的表達(dá)量較高(表6)。

        2.5 氣味結(jié)合蛋白家族基因的鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

        本研究共鑒定到19個(gè)OBP,包括2個(gè)普通氣味結(jié)合蛋白(general odorant binding protein,GOBP)和2個(gè)性信息素結(jié)合蛋白(pheromone binding protein,PBP),分別命名為HvitGOBP1、HvitGOBP2、HvitPBP1和HvitPBP2,其他序列命名為HvitOBP1~HvitOBP4和HvitOBP6~HvitOBP16(未鑒定到HvitOBP5),GenBank 登錄號(hào)為MW717382~MW717400(表7)。其中,有14個(gè)OBP基因獲得了全長(zhǎng),氨基酸序列長(zhǎng)度在138~337 aa之間。根據(jù)氨基酸序列結(jié)構(gòu)和進(jìn)化分析(圖4),HvitGOBP1、HvitGOBP2、HvitPBP1、HvitPBP2、HvitOBP2、HvitOBP9~HvitOBP11、HvitOBP13~HvitOBP15屬于Classic亞家族;HvitOBP4、HvitOBP6和HvitOBP12屬于Minus-C亞家族;HvitOBP1、HvitOBP3、HvitOBP7、HvitOBP8和HvitOBP16屬于Plus-C亞家族。DEG結(jié)果表明,HvitGOBP2、HvitPBP1、HvitPBP2、HvitOBP2、HvitOBP10、HvitOBP11、HvitOBP13和HvitOBP15均在雄蟲(chóng)口器中高表達(dá),并且表達(dá)量為雌蟲(chóng)口器的10倍以上(表7)。

        2.6 化學(xué)感受蛋白家族基因的鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

        本研究共鑒定到17個(gè)CSP,命名為HvitCSP1~HvitCSP4和HvitCSP7~HvitCSP19(未鑒定到HvitCSP5和HvitCSP6),GenBank 登錄號(hào)為MW717401~MW717416,其中HvitCSP9由于序列長(zhǎng)度過(guò)短,未上傳(表8)。共有10個(gè)CSP為全長(zhǎng)基因序列,且均具有4個(gè)保守的半胱氨酸結(jié)構(gòu),氨基酸序列長(zhǎng)度在109~154 aa。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明(圖5),所有候選CSP基因都與至少一個(gè)鱗翅目同源基因聚在一支上。DEG結(jié)果表明,HvitCSP2在雌雄觸角和口器中表達(dá)量最高,HvitCSP17和HvitCSP19在雌性觸角中偏好表達(dá)(表達(dá)量大于雄性3倍以上)。此外,HvitCSP8、HvitCSP15和HvitCSP17在雄性口器偏好表達(dá)(表達(dá)量大于雌性3倍以上)(表8)。

        2.7 感覺(jué)神經(jīng)元膜蛋白家族基因的鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

        通過(guò)對(duì)黃野螟觸角與口器轉(zhuǎn)錄組的分析,共鑒定到2個(gè)具有全長(zhǎng)基因序列的SNMP,命名為HvitSNMP1和HvitSNMP2,氨基酸長(zhǎng)度分別為527 aa和524 aa,GenBank 登錄號(hào)為MW717417和MW717418(表9)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明(圖6),HvitSNMP1和HvitSNMP2與其他鱗翅目物種的SNMP基因處在不同的分支。DEG結(jié)果表明,HvitSNMP1在雄性口器中高表達(dá)(表達(dá)量大于雌性10倍以上)(表9)。

        3 討論

        以性誘劑為主的新型害蟲(chóng)綠色防控技術(shù)具有安全、高效和環(huán)保等優(yōu)點(diǎn),其在林業(yè)害蟲(chóng)的防控中發(fā)揮了重要作用。研究害蟲(chóng)的化學(xué)感受基因,有利于深入了解害蟲(chóng)的嗅覺(jué)系統(tǒng),進(jìn)而開(kāi)發(fā)更高效的害蟲(chóng)嗅覺(jué)行為調(diào)控劑。高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,極大地促進(jìn)了害蟲(chóng)化學(xué)生態(tài)學(xué)研究[19]。本研究采用Illumina HiSeqTM 2000高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)黃野螟成蟲(chóng)觸角與口器中表達(dá)的化學(xué)感受基因進(jìn)行了全面的鑒定與分析,共鑒定到124個(gè)化學(xué)感受基因,包括50個(gè)OR、19個(gè)IR、17個(gè)GR、19個(gè)OBP、17個(gè)CSP和2個(gè)SNMP。相對(duì)于之前的研究[18],本研究新鑒定到22個(gè)OR、7個(gè)IR、13個(gè)GR、11個(gè)OBP和9個(gè)CSP,未鑒定到HvitOBP5、HvitCSP5和HvitCSP6,但是鑒定到的基因數(shù)量和質(zhì)量均優(yōu)于之前的研究。本研究為進(jìn)一步研究黃野螟的化學(xué)感受機(jī)制提供了分子基礎(chǔ),為開(kāi)發(fā)以化學(xué)生態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的黃野螟綠色害蟲(chóng)防控技術(shù)提供了理論依據(jù)。

        昆蟲(chóng)OR是一種跨膜受體蛋白,具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。傳統(tǒng)氣味受體(conventional odorant receptor,OrX)是一個(gè)高度分化的受體家族,需要與高度保守的氣味受體共受體結(jié)合形成異源多聚體,共同完成識(shí)別氣味分子的功能[5]。本研究在黃野螟中鑒定到50個(gè)OR,數(shù)量與其他鱗翅目近緣昆蟲(chóng)接近[20]。然而,在黃野螟的50個(gè)OR中僅鑒定到3個(gè)性信息素受體(PR),數(shù)量低于其他鱗翅目近緣物種,例如,亞洲玉米螟和桃蛀螟中均鑒定到8個(gè)PR,小菜蛾P(guān)lutella xylostella中鑒定到9個(gè)PR[2123]。在黃野螟的3個(gè)PR中,僅HvitOR42和HvitOR43在雄性觸角中高表達(dá),可能與識(shí)別雌性性信息素相關(guān)。此外,在?;页嵋苟闟podoptera littoralis的研究中發(fā)現(xiàn),SlitOR5可以特異性識(shí)別性信息素組分(Z,E)-9,11-14∶OAc,該受體所在的分支為“新PR”分支[24]。在本研究中,雖然HvitOR8、HvitOR30、HvitOR31、HvitOR32、HvitOR38、HvitOR44聚在“新PR”分支上,但是它們并未在雄蟲(chóng)觸角中高表達(dá)。值得注意的是,HvitOR20在雌性觸角中高表達(dá),說(shuō)明其可能在雌蟲(chóng)產(chǎn)卵相關(guān)行為中發(fā)揮作用。

        IR由離子型谷氨酸受體超家族(iGluRs)進(jìn)化而來(lái),主要在觸角中表達(dá),用于識(shí)別酸、胺以及溫、濕度等[25]。在本研究中,我們共鑒定到19個(gè)IR,進(jìn)化分析結(jié)果表明,黃野螟IR聚在4個(gè)不同分支,可能具有不同的潛在功能。在第一分支中,HvitIR8a和HvitIR25a在不同物種間相對(duì)保守,有研究表明這兩種IR發(fā)揮了共受體的功能[26]。在第二分支中,HvitIR76b與HvitIR93a聚為同一分支,其中IR76b被認(rèn)為可能是第二類共受體[2627]。第三分支中的IR主要與昆蟲(chóng)非化學(xué)感受相關(guān),如果蠅的IR40a和IR68a參與了昆蟲(chóng)的濕度感受[28]。第四分支中的IR主要參與酸類化合物識(shí)別,果蠅的IR64a和IR75a與IR8a共表達(dá)可分別被乙酸和苯乙酸激活[26, 28]。值得注意的是,在第二分支中,HvitIR41a與其他物種相比發(fā)生了特異性序列分化,可能與黃野螟的特異性行為相關(guān),但具體功能還有待進(jìn)一步研究。在果蠅IR的研究中,IR41a與IR76b共表達(dá)用于識(shí)別多胺類物質(zhì),這類物質(zhì)對(duì)果蠅有吸引作用[29]。

        根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和功能研究,GR可分為4個(gè)分支:二氧化碳受體分支、糖受體分支、果糖受體分支和苦味受體分支[3032]。在果蠅和家蠶基因組中分別鑒定到56個(gè)和65個(gè)GR[3233]。在黃野螟中,我們僅鑒定出17個(gè)GR,與桃蛀螟[22]和草地螟Loxostege sticticalis[34]的GR數(shù)量相似,但數(shù)量少于果蠅和家蠶,表明GR可能存在于除成蟲(chóng)觸角和口器之外的其他組織中。進(jìn)化分析結(jié)果顯示,HvitGR1~HvitGR3為CO2受體,HvitGR4~HvitGR8為糖受體,HvitGR9~HvitGR12為果糖受體,HvitGR13-HvitGR17為苦味受體。目前關(guān)于GR功能研究多集中在CO2受體、糖受體和果糖受體,而關(guān)于苦味受體的功能研究報(bào)道相對(duì)較少。在家蠶中,BmorGR66基因突變可導(dǎo)致家蠶喪失對(duì)桑葉的專食性[35]。在小菜蛾中,PxylGR34基因的表達(dá)介導(dǎo)了小菜蛾對(duì)油菜素內(nèi)酯的厭惡行為反應(yīng)[36]。這些研究對(duì)了解黃野螟寡食性的分子機(jī)制具有指導(dǎo)意義。

        OBP和CSP是一類具有典型分子特征的水溶性小分子蛋白,在多個(gè)組織中均有表達(dá)且表達(dá)量較高,主要參與氣味分子的運(yùn)輸。典型的OBP和CSP序列分別具有6個(gè)和4個(gè)保守的半胱氨酸,通過(guò)相互交叉形成二硫鍵影響OBP和CSP的三維結(jié)構(gòu)。OBP和CSP的特異性表達(dá)一定程度上暗示了它們?cè)诶ハx(chóng)生命活動(dòng)中的作用。除了在觸角和口器中表達(dá)以外,OBP和CSP也在生殖器和足等多種組織中表達(dá)[37]。此外,OBP和CSP也具有性別特異性高表達(dá),這可能與雌蟲(chóng)或雄蟲(chóng)的特異性生理和行為有關(guān)。在本文中,HvitGOBP2、HvitPBP1和HvitPBP2等8個(gè)OBP在口器中均為雄性高表達(dá)(表達(dá)量大于雌性10倍以上),HvitCSP8、HvitCSP15和HvitCSP17在雄性口器中偏好表達(dá)(表達(dá)量大于雌性3倍以上),可能與性信息素的識(shí)別相關(guān)。

        SNMP是一種膜蛋白,且數(shù)量較少,在大多數(shù)鱗翅目昆蟲(chóng)都只有2個(gè)。SNMP1主要分布在觸角中,與性信息素特異性神經(jīng)元有關(guān),并參與昆蟲(chóng)對(duì)性信息素的識(shí)別過(guò)程[38]。SNMP2在昆蟲(chóng)中的功能尚不明確,具體功能有待進(jìn)一步的研究。此外,最近通過(guò)基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析,在鱗翅目昆蟲(chóng)中鑒定出SNMP3基因,它在幼蟲(chóng)中腸特異性表達(dá),具體功能尚未明確[39]。

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        (責(zé)任編輯:楊明麗)

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