王青 任杰群 圖爾罕?麥麥提伊敏 陳國康 黨婷婷 羅朝喜 馬冠華

摘要 ：近年隨著鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)調(diào)整和果業(yè)發(fā)展，褐腐病在我國的發(fā)生呈加重趨勢。本文對重慶地區(qū)核果類果樹褐腐病的發(fā)生狀況做了調(diào)查分析，在室內(nèi)通過平板及離體果實試驗，篩選拮抗菌和化學藥劑，為田間防治實踐提供科學依據(jù)。主要結(jié)果如下：桃褐腐病在重慶普遍發(fā)生，核果類果樹均易感，病原菌經(jīng)鑒定為果生鏈核盤菌Monilinia fructicola;系統(tǒng)調(diào)查初步分析發(fā)現(xiàn)，降雨時間與李褐腐病發(fā)生發(fā)展關(guān)系最密切，其與病情指數(shù)增幅的相關(guān)系數(shù)R=0.94（P<0.05）;平板對峙和離體桃果篩選，獲得2株有生防潛力的放線菌YLS5-2和YYDB3-1，二者的抑菌率分別為91.3%和84.5%，相對防效分別為65.1%和67.1%，可能具有較好的應用前景;平板毒力測定和離體桃果控病試驗，效果最優(yōu)的化學藥劑分別為戊唑醇、苯甲·丙環(huán)唑，其中戊唑醇在推薦濃度處理96 h其離體果實防效仍維持在100%水平。

關(guān)鍵詞 ：果生鏈核盤菌; 發(fā)生調(diào)查; 拮抗放線菌; 化學藥劑

中圖分類號：

S 436.62

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020392

Preliminary study on the incidence and control of brown rot on stone fruit trees in Chongqing

WANG Qing1， REN Jiequn2， TUERHAN·Maimaitiyimin1，3， CHEN Guokang1，

DANG Tingting1， LUO Chaoxi4， MA Guanhua1*

（1.College of Plant Protection， Southwest University， Chongqing 400716， China;

2.Chongqing Three Gorges Academy of Agriculture Science， Wanzhou 404155， China;

3.Kashi Custom， The People’s Republic of China， Kashi 844000， China; 4.College of

Plant Science and Technology， Huazhong Agriculture University， Wuhan 430070， China）

Abstract

With the adjustment and development of countryside production， brown rot is getting more serious in China.In this study， the incidence of brown rot on stone fruit trees was investigated and control experiments in vitro peaches were conducted in laboratory.The results indicated that brown rot disease occurred generally in Chongqing areas， and all stone fruits were susceptible to the pathogen， which was finally identified as Monilinia fructicola after single spore isolation.The systematic investigation suggested the rainfall time （h） was the main factor affecting disease increase， with the positive correlation coefficient of 0.94.The inhibiting effects of two actinomycetes strains YLS5-2， YYDB3-1 were 91.3% and 84.5% against M.fructicola on plates， while the relative control efficacies were 65.1% and 67.1% to peach brown rot in vitro fruits， respectively， suggesting that they had potential application prospects in field control.The results of toxicity detection and control tests of six fungicides showed tebuconazole and benzoyl propiconazole had better effects， especially tebuconazole showing more persistent control efficacy in vitro peach fruits in recommended concentrations within 96 hours.

Key words

Monilinia fructicola; incidence investigation; antagonistic actinomycete; fungicide

褐腐?。╞rown rot）是核果類作物重要的真菌病害，可危害桃、李、杏、櫻桃等果樹，病原菌包括美澳型果生鏈核盤菌Monilinia fructicola、松散鏈核盤菌M.laxa、果生鏈核盤菌M.fructigena、云南鏈核盤菌M.yunnanesis、梅果串珠霉Monilia mumecola等，在我國大部分省區(qū)以M.fructicola為優(yōu)勢種[1]。褐腐病在世界主要桃產(chǎn)區(qū)均有分布[23]，我國四川、貴州、云南、河南、山東、北京等16個省市有發(fā)生報道[45]。該病主要危害果實，引起果實腐爛、失水干縮形成僵果，也感染花、葉和幼嫩枝梢，造成花、葉和枝干枯萎[69]。在我國桃產(chǎn)區(qū)雨水偏多年份，該病發(fā)生加重，造成爛果是果園安全生產(chǎn)的主要威脅[1011];果品儲運期間也極易發(fā)生褐腐病造成產(chǎn)后損失[1213]。病菌以菌絲在僵果或枝梢潰瘍部越冬，由分生孢子借助風雨進行侵染[1417]。

褐腐病的防控須從果樹休眠期著手貫穿整個生育期，綜合運用農(nóng)業(yè)、化學、生物等多種防治措施[78]，如通過果園合理施肥，提高果樹自身抗病力?；蛘咄ㄟ^嚴格清除園內(nèi)褐腐病僵果及病殘體，能顯著壓低病原菌在桃園的越冬基數(shù)，可減少病害初侵染源?；瘜W防治在桃褐腐病的防治實踐中占據(jù)重要的地位[17]，利用拮抗菌等微生物資源防治采后爛果也是近年來的研究熱點[1822]。

重慶山地桃、李種植歷史悠久，近年隨著國家鄉(xiāng)村振興和脫貧政策的推行，桃和李水果產(chǎn)業(yè)呈發(fā)展壯大之勢，但有關(guān)褐腐病在重慶核果類果樹的發(fā)生情況和有效防治手段尚不明確。鑒于此，本文開展了褐腐病在重慶的發(fā)生狀況調(diào)查，以及初步的防病試驗探索，以基本明確其發(fā)病規(guī)律，為褐腐病科學防控提供依據(jù)和可能途徑。

1 材料與方法

1.1 重慶地區(qū)褐腐病發(fā)生調(diào)查

2014年-2017年在重慶市代表區(qū)縣開展核果類果樹褐腐病調(diào)查采樣，帶回室內(nèi)進行分離鑒定。同時在北碚區(qū)縉云山（106oE，29oN）農(nóng)家普種的李園開展褐腐病發(fā)生發(fā)展系統(tǒng)調(diào)查。于2014年5月-7月采用五點法每7 d調(diào)查1次，統(tǒng)計病果率和病情指數(shù)。鑒于褐腐病尚無統(tǒng)一的分級標準，依據(jù)田間褐腐病病斑擴展危害特點，參照木瓜褐腐病標準[23]，改進擬定了0～9級標準，用以計算病情指數(shù)。0級：無病斑，1級：病斑面積占整個果面積6%以下，3級：病斑面積占整個果面積6%～15%，5級：病斑面積占整個果面積16%～25%，7級：病斑面積占整個果面積26%～50%，9級：病斑面積占整個果面積50%以上。當?shù)赝跉庀髷?shù)據(jù)資料由重慶市北碚區(qū)氣象局提供。

對分離獲得的單孢菌株鏡檢觀察其菌絲和分生孢子形態(tài)，委托華中農(nóng)業(yè)大學進行rDNA-ITS分子鑒定。采用針刺傷口接種法，將分離物菌餅（直徑6 mm）菌絲面朝下回接于桃果上（成熟期，品種為‘巴南香’），25℃溫室培養(yǎng)至發(fā)病，再從發(fā)病果實病健交界處分離病原菌，完成柯赫氏法則驗證。

1.2 拮抗放線菌篩選及離體控病試驗

供試放線菌菌株由西南大學植物生態(tài)病理研究所菌種資源庫提供，分離自烤煙黑脛病田健康煙株根圍。采用平板對峙法測定供試放線菌的抑菌帶寬，計算其抑菌率[24]。以桃褐腐菌株CH-4-1（M.fructicola，單孢分離自巴南區(qū)發(fā)病桃果）為靶標菌。用移植餌蘸取待測放線菌菌株（活化前保藏于甘油瓶內(nèi)），在PDA平板距中心25 mm處劃30 mm長的直線，28℃培養(yǎng)2 d后，在平板中央接種直徑為6 mm的桃褐腐菌菌餅，每個菌株重復3次，28℃培養(yǎng)7 d后測量各處理的病原菌菌落直徑。依據(jù)對照與各處理菌落直徑的差值，占對照直徑的百分比，計算相對抑制率。

離體果實試驗方法，采用菌餅無傷接種法[2527]。選擇相同品種、外觀一致、成熟度相同的健康桃果（成熟期‘巴南香’），以蒸餾水沖洗5 min，75%乙醇表面消毒2 min，自然風干備用。處理1：果實先用拮抗菌發(fā)酵液浸泡2 min，1 h后在果實相對兩側(cè)面貼6 mm的桃褐腐菌菌餅，菌絲面朝下;處理2：發(fā)病對照（CK1），果實不浸泡拮抗菌發(fā)酵液只接病原菌菌餅;處理3：清水對照（CK2），果實只浸泡無菌水;處理 4：發(fā)酵液對照（CK3），果實只浸泡拮抗菌發(fā)酵液。每個處理重復3次，每個重復5個果實，在25℃，光照L∥D=12 h∥12 h，相對濕度約95%條件下培養(yǎng)。從接種病原菌到果實全部腐爛，每隔12 h觀察記錄發(fā)病情況，測量病斑直徑，依據(jù)對照與各處理病斑直徑的差值，占對照病斑（CK1）直徑的百分比，計算相對防效。

拮抗放線菌發(fā)酵液的制備方法：拮抗放線菌于高氏一號培養(yǎng)基上28℃活化4 d后，再接種于盛有100 mL高氏一號液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)4 d;然后按2%（V/V）接種量于液體培養(yǎng)基中再次振蕩培養(yǎng)5 d。使用前加0.5%體積比吐溫-80，備用。

1.3 化學藥劑抑菌測定及離體控病試驗

采用菌絲生長速率法，測定化學藥劑對桃褐腐病菌菌株CH-4-1菌絲生長的抑制作用[1011]，選擇文獻報道生產(chǎn)上常用的廣譜殺菌劑，由東莞市瑞德豐生物科技有限公司生產(chǎn)的8%苯甲·中生可濕性粉劑（WP）、50%腐霉利可濕性粉劑（WP）、300 g/L苯甲·丙環(huán)唑乳油（EC）、430 g/L戊唑醇懸浮劑（SC）、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑（WP）、75%百菌清可濕性粉劑（WP） 6種化學藥劑。打取直徑6 mm菌餅接種于含有0.1、0.5、1、10、100 μg/mL 5個不同濃度藥劑的PDA平板上，以加l mL無菌水培養(yǎng)基為對照，每個濃度重復4次。在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，計算殺菌劑對菌絲體生長的相對抑制率，并建立毒力回歸方程y=a+bx，計算化學藥劑EC 50和相關(guān)系數(shù)。根據(jù)EC 50評價殺菌劑毒力[10]：EC 50≤0.01 μg/mL，很強;0.01 μg/mL<EC 50≤0.1 μg/mL，強;0.1 μg/mL<EC 50≤1.0 μg/mL，較強;1.0 μg/mL<EC 50≤5.0 μg/mL，中等;5.0 μg/mL<EC 50≤10.0 μg/mL，較弱;EC 50>10.0 μg/mL，弱。

化學藥劑離體控病試驗，采用菌餅無傷接種法，具體處理如下，處理1：桃果（成熟期‘巴南香’）先用化學藥劑按質(zhì)量百分比濃度稀釋液浸泡2 min，1 h后在果實相對兩側(cè)面貼6 mm的病原菌菌餅，菌絲面朝下;處理2：發(fā)病對照（CK1），果實不浸泡化學藥劑，只接病原菌;處理3：清水對照（CK2），果實只浸泡無菌水。測量病斑直徑，依據(jù)對照與各處理病斑直徑的差值，占對照病斑直徑的百分比，計算相對防效。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐腐病在重慶地區(qū)的發(fā)生狀況

2014年-2017年通過對重慶果樹主要種植區(qū)縣實地調(diào)查，發(fā)現(xiàn)褐腐病在該地區(qū)發(fā)生較為普遍，包括北碚區(qū)、渝北區(qū)、巴南區(qū)、合川區(qū)、永川區(qū)、涪陵區(qū)、南川區(qū)、酉陽縣、墊江縣，基本涵蓋重慶東南西北及中心區(qū)域。褐腐病危害果樹，包括櫻桃（4月）、杏（5月）、桃（5、6月）、李（6、7月）;其中李褐腐病普遍發(fā)生、受害嚴重，其次是桃褐腐病，櫻桃盡管種植普遍，但僅在巴南區(qū)采集到病害樣本，由于杏在重慶各地種植稀少，其調(diào)查地點十分有限，僅在墊江縣五洞鎮(zhèn)果園采集到病害樣本。

對重慶各區(qū)縣采集的桃、李、杏褐腐病病果，通過單孢分離、形態(tài)學觀察、致病性測定，并委托華中農(nóng)業(yè)大學羅朝喜實驗室進行分子鑒定，對送檢的代表性菌株采用多重PCR檢測，均擴增獲得354 bp特異性片段，確定為果生鏈核盤菌M.fructicola，形態(tài)特征見圖1。在致病性回接試驗中，從接種后發(fā)病的果實上再次分離到與接種體形態(tài)特征完全一致的菌株。

2.2 影響褐腐病發(fā)生的氣象因子分析

初步分析李褐腐病的系統(tǒng)調(diào)查數(shù)據(jù)與溫濕度、降雨量等氣象因子之間的關(guān)系（表1），結(jié)果顯示：病情指數(shù)在6月11-16日時間段的增幅最大（12.1），由9.7突增至21.8;其次是6月21-26日時間段，增幅為7.6。這兩個時間段的平均濕度均在95.0%以上，且濕度增幅較大;濕度增大源于降雨因素，包括時段內(nèi)降雨時間（h）、時段內(nèi)降雨量（mm）的增加。特別是6月12-16日時間段，降雨時間累計49 h，較上個時段6月7-11日的22 h增加27 h，降雨量由13.1 mm陡增至53.0 mm，增加近40 mm，與病情指數(shù)增幅形成呼應，病情指數(shù)增幅與降雨時間的相關(guān)性顯著（R=0.94，P<0.05），與降雨量的相關(guān)性不顯著（R=0.64，P>0.05）。而同期氣溫因降雨而降低，與病情指數(shù)增幅之間無相關(guān)性（R=0.04）。

2.3 拮抗生防菌篩選及離體控病效果

通過平板篩選測定（表2，圖2），獲得拮抗效果較好的放線菌11株，其中放線菌YLS5-2和YYDB3-1的平板抑菌效果最好，分別達到91.3%和84.5%。

選取平板拮抗作用最強的兩株菌YLS5-2和YYDB3-1進行離體果實控病試驗（圖3）。結(jié)果顯示，二者的相對防效在接種病原菌后60 h達最高值，分別為65.1%和67.1%，其中菌株YYDB3-1在48～120 h的防效持續(xù)高于YLS5-2;60 h后二者防效均呈下降趨勢，但菌株YYDB3-1處理的病斑擴展較慢，防效下降相對平緩，表現(xiàn)出較強的穩(wěn)定性。

2.4 化學藥劑抑菌測定及離體控病效果

6種供試化學藥劑的抑菌能力從高到低依次為（表3）：300 g/L苯甲·丙環(huán)唑EC、430 g/L戊唑醇SC、70%甲基硫菌靈WP、75%百菌清WP、8%苯甲·中生WP、50%腐霉利WP。比較上述藥劑的離體控病效果，發(fā)現(xiàn)430 g/L戊唑醇SC的防治效果最好且比較穩(wěn)定，其質(zhì)量濃度500倍、1 000倍稀釋液處理96 h的相對防效均為100%，傷口處未見有病斑（圖4），而同期百菌清等其他藥劑均出現(xiàn)較明顯的擴大病斑。如百菌清1 000倍處理96 h的病斑直徑34.7 mm，而發(fā)病對照為46.6 mm，其相對防效僅為25.5%。

3 討論

研究初步明確了褐腐病在重慶地區(qū)核果類作物的發(fā)生危害狀況，且從桃、李、杏果實上獲得的褐腐菌單孢，經(jīng)鑒定均為果生鏈核盤菌Monilinia fructicola。Yin等僅在巴南區(qū)烏皮櫻桃上發(fā)現(xiàn)了M.mumecola[28]，這表明M.fructicola是重慶地區(qū)的優(yōu)勢種，而有關(guān)種間是否存在消長動態(tài)，還需要較長期的跟蹤監(jiān)測來證實。華中農(nóng)業(yè)大學開發(fā)的多重PCR檢測方法能區(qū)分我國褐腐菌主要類群，從M.fructicola、M.yunnanensis和M.mumecola褐腐病菌擴增出的特異片段長度分別為354、237 bp和712 bp[1]。

分析發(fā)現(xiàn)褐腐病在李園的發(fā)生趨勢與降雨時間成顯著正相關(guān)，而與降雨量、氣溫、濕度等無顯著相關(guān)性，與前人的部分研究報道一致[1517]。一段時間內(nèi)累積的降雨時間，可能影響著病原菌在果園侵染及擴展，該研究結(jié)果為重慶山地果園確定褐腐病的防控關(guān)鍵時間提供了科學的預警依據(jù)。

試驗篩選出2株對桃褐腐病菌有較強拮抗作用的放線菌，在離體果實控病試驗中表現(xiàn)優(yōu)良。這為深入研究應用拮抗放線菌控制褐腐病奠定了基礎(chǔ)，拮抗菌株次生代謝產(chǎn)物的成分及生物活性有待進一步研究。

平板抑菌活性和離體控病試驗表明，桃褐腐菌對戊唑醇更為敏感，戊唑醇防病效果最好。這與前人的研究結(jié)論一致，何獻聲測定了19種殺菌劑對桃褐腐菌的抑制活性，結(jié)果顯示戊唑醇具有較高的抑菌活性[11];紀兆林等測定了15種殺菌劑對桃褐腐菌的抑制活性，結(jié)果顯示戊唑醇、甲基硫菌靈、腐霉利等藥劑的EC 50在0.080 2～51.590 0 μg/mL之間[10]，也與本研究選用的6種藥劑EC 50范圍接近。綜合考慮認為，化學藥劑戊唑醇可能具有更好的褐腐病防控應用優(yōu)勢。

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（責任編輯：田 喆）