葛辰等

摘要：大鱗副泥鰍是鰍科重要經(jīng)濟(jì)魚類，通過Illumina HiSeq 2000測序平臺對2個(gè)大鱗副泥鰍樣本的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了高通量測序，其中AB2011M-1是群體中生長較快的10尾魚的混合轉(zhuǎn)錄本，AB2011M-2是生長較慢的10尾魚的混合轉(zhuǎn)錄本。通過對以上2個(gè)混合轉(zhuǎn)錄本的測序，分別獲得了65 536和80 786個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）突變；對2個(gè)測序樣本進(jìn)行表達(dá)差異的比較，獲得了39個(gè)表達(dá)差異基因。隨機(jī)選取120個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行驗(yàn)證分析，共獲得16個(gè)有效的多態(tài)性標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：大鱗副泥鰍；高通量測序；SNP；多態(tài)性標(biāo)記；引物設(shè)計(jì)

中圖分類號： S917.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0021-07

主要從事魚類遺傳育種與保護(hù)生物學(xué)研究。E-mail：lingqf@suda.edu.cn。大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）屬鯉形目鰍科花鰍亞科副泥鰍屬，別稱板鰍、黃板鰍，是一種底棲雜食性淡水魚類，主要分布于東亞地區(qū)。大鱗副泥鰍的肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富[1]，近幾年來，其市場需求量不斷增大，已成為我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖物種[2]。

育種是應(yīng)用各種遺傳學(xué)方法，改造生物的遺傳結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種的目標(biāo)[3]。通過傳統(tǒng)育種方法獲得一個(gè)新品種需要經(jīng)過5代以上人工選擇[4]，因此，利用傳統(tǒng)的育種方法獲得優(yōu)良品系需要投入大量的時(shí)間、人工和資源；且育種操作多憑經(jīng)驗(yàn)來控制選擇手段，影響因素較多，不能快速滿足當(dāng)前漁業(yè)發(fā)展對水產(chǎn)良種的需要。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記輔助育種（molecular assisted selection，MAS）技術(shù)已日趨成熟。最早應(yīng)用于MAS育種的分子標(biāo)記有限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài) DNA （random amplified polymorphic DNA，RAPD）[5]、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）[6]等標(biāo)記方法。近年來，簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat，SSR）和單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）也被應(yīng)用于MAS育種[6-7]。其中，SNP作為新興的分子標(biāo)記，擁有數(shù)目多、分布廣、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)而廣泛受到關(guān)注。

篩選未知或已知SNP的方法有等位基因特異寡核苷酸片段分析（allele-specific oligonucleotide，ASO）[8]、基因芯片技術(shù)（gene chips）[9]、探針技術(shù)（TaqMan）[10]、AFLP[11]、變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）、單鏈構(gòu)想多態(tài)性（single strand conformation polymorphism，SSCP）[12]、直接測序等方法。這些方法各有所長，在不同的分析領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。其中，最快捷、開發(fā)量最大的是高通量測序方法，該方法通過不同個(gè)體的同一DNA片段的直接測序以及序列比對，使SNP突變的檢出率可達(dá)100%，且可以直接得到突變堿基的類型及其準(zhǔn)確位置等 SNPs 分型的參數(shù)[13-14]。

在水產(chǎn)動物中，鯉[15]、草魚[16]、大口黑鱸[17]、櫛孔扇貝[18]等均已有SNP的研究報(bào)道，但迄今為止，尚未見到通過高通量測序批量開發(fā)大鱗副泥鰍SNP的研究報(bào)道。本研究旨在開發(fā)與生長差異相關(guān)的多態(tài)性SNP標(biāo)記，為大鱗副泥鰍的分子育種奠定理論基礎(chǔ)和實(shí)踐方法。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

2011年，以400組洪澤湖野生大鱗副泥鰍為親本，進(jìn)行人工繁殖，獲得1個(gè)混合選育群體。2012年10月，隨機(jī)采樣200尾子代，測量體寬、體長、全長、周長、體厚和體重等性狀指標(biāo)，然后選取生長顯著快速的10尾魚[體質(zhì)量（11.02±103） g]和顯著緩慢的10尾魚[體質(zhì)量（2.25±0.36） g]，分別標(biāo)志為混合樣本AB2011M-1和AB2011M-2。分別提取以上2組試驗(yàn)魚的肌肉組織，于RNA樣本保存液 （D311A，TaKaRa） 中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2RNA的提取與轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建

用TRIzol 試劑對樣本肌肉組織提取總RNA，等量混合成快、慢2個(gè)轉(zhuǎn)錄組測序樣本。對cDNA庫進(jìn)行片段長度的篩選，進(jìn)行PCR擴(kuò)增（使用Phusion DNA聚合酶，共15個(gè)循環(huán)），擴(kuò)增產(chǎn)物由2%瓊脂糖電泳檢測，回收300～500 bp的cDNA片段。

1.3轉(zhuǎn)錄組測序與組裝

通過TBS-380微型熒光計(jì)的定量化測定，具有雙末端的cDNA片段在Illumina HiSeq 2000 （讀長長度為2×100 bp）平臺上進(jìn)行測序。

使用SeqPre（https：//github.com/jstjohn/SeqPrep） 和condetri_v2.0.pl （http：//code.google.com/p/condetri/downloads/detail？name=condetri_v2.0.pl ）軟件進(jìn)行序列除雜。用Trinity軟件對去雜后片段進(jìn)行序列組裝和拼接（http：//trinityrnaseq.sourceforge.net/）。

1.4轉(zhuǎn)錄本基因注釋

使用蛋白質(zhì)非冗余數(shù)據(jù)庫（NR數(shù)據(jù)庫）中的的BlastX程序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本的比對，E值的設(shè)定為小于1.0×10-5[19]。比對獲得的序列使用Blast 2 GO軟件進(jìn)行GO（gene ontology）注釋[20]，GO分類使用in-house perl scripts[21]；然后使用軟件blastx/blastp 2.2.24+對序列進(jìn)行KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）分析。

1.5SNP分析

將拼接好的序列作為對比模板，通過軟件Samtools （http：//samtools.sourceforge.net/）和VarScan v.2.2.7（http：//varscan.sourceforge.net/）將從AB2011M-1和AB2011M-2中獲得的序列信息分別與模板進(jìn)行對比，得到候選SNP的信息。根據(jù)分析結(jié)果，選取差異基因所含的SNP，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行驗(yàn)證。用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為 20 μL，包含1 μL DNA模板，10 μL 2× PCR Mix（CW2296，世紀(jì)康為），上下游引物各1 μL，7μL H2O。PCR反應(yīng)循環(huán)流程為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物首先通過2%瓊脂糖電泳進(jìn)行初步篩選，具有清晰條帶的標(biāo)記再通過6%聚丙烯凝膠電泳進(jìn)行基因分型。在進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳前，用SSCP變性劑對產(chǎn)物進(jìn)行95 ℃變性10 min，并立即冰浴處理。SSCP變性劑配方包括49 mL去離子甲酰胺、1 mL 0.5 mol/L EDTA（pH值8.0）、0.1 g溴酚藍(lán)、0.1 g二甲苯青FF。DNA分子質(zhì)量標(biāo)記采用Takara公司的DL-1 000 DNA marker。

2結(jié)果與分析

2.1數(shù)據(jù)的篩選、拼接與注釋

3討論與結(jié)論

3.1測序結(jié)果注釋

在本研究中，58.56%的序列預(yù)測到ORFs，60.98%的序列在NR數(shù)據(jù)庫中得到注釋，注釋到的基因參與了大鱗副泥鰍的代謝和其他生物過程，沒有被注釋到的基因可能是此物種的特異基因，需要通過進(jìn)一步的研究將這些特異基因擴(kuò)充至各個(gè)數(shù)據(jù)庫中，以豐富數(shù)據(jù)庫的內(nèi)容。

3.2SNP的開發(fā)

本研究通過第二代測序技術(shù)在2個(gè)樣本中分別獲得 65 536 和80 786個(gè)SNP。由于是對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測序，因此，這些SNP又稱為cSNP。cSNP在轉(zhuǎn)錄區(qū)域形成的頻率遠(yuǎn)低于非轉(zhuǎn)錄區(qū)[22]，在生物進(jìn)化中這是為了保護(hù)物種的穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)錄區(qū)發(fā)生的非同義SNP突變可能會在進(jìn)化過程中被淘汰，達(dá)到保護(hù)的目的[23]。cSNP與相關(guān)性狀有重要的聯(lián)系，因此，cSNP 往往具有重要的研究價(jià)值，可以為進(jìn)一步的相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)、代謝通路、遺傳作圖研究提供有效的工具，為分子育種奠定基礎(chǔ)。

SNP突變形式有轉(zhuǎn)換（C/T，G/A）和顛換（C/A，G/T，C/G，A/T），研究表明轉(zhuǎn)換出現(xiàn)的頻率約為顛換頻率的2倍[24]。本研究中，轉(zhuǎn)換/顛換為1.39，和Manuel等人對比目魚 EST-SNP 研究結(jié)果相近（1.408）[25]，與鮭魚[26]、烏頰魚[27]和斑馬魚[28]的EST-SNP研究結(jié)果（1.885）有一定差距，表明了不同生物在進(jìn)化過程中承受著不同的進(jìn)化壓力[22]。

3.3SNP的驗(yàn)證

SNP是單個(gè)堿基引起的突變，在檢測中可能會造成假陽性，影響試驗(yàn)的準(zhǔn)確性[25-26]，因此，采取32個(gè)個(gè)體重復(fù)2次SSCP檢測，以消除假陽性干擾。本研究SNP驗(yàn)證率（239%）較預(yù)期（50%）低，可能是由于使用的擴(kuò)增模板是DNA，其中的內(nèi)含子會同時(shí)被擴(kuò)增出來。內(nèi)含子也可能存在SNP的干擾，造成擴(kuò)增片段長度過大、擴(kuò)增條帶多而雜，降低了在聚丙烯凝膠電泳中的分辨率[29]，由此造成某些具有多態(tài)的SNP無法被鑒定。

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