許煒民，錢佳佳，韓龍，許奇，黃桂成,2*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210023)

膝骨關(guān)節(jié)炎是我國乃至世界范圍內(nèi)中老年的常見病之一，其發(fā)生發(fā)展的過程與年齡、體質(zhì)量、創(chuàng)傷、運(yùn)動習(xí)慣、地理環(huán)境等諸多因素密切相關(guān)。膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，給廣大患者日常生活造成了極大的痛苦與不便。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國60周歲以上的人群中，其中65歲以上人群發(fā)病率超過50%，75歲以上人群則高于80%[1]。。江蘇省中醫(yī)院黃桂成教授在治療此類疾病時，認(rèn)為其發(fā)病機(jī)理無非是風(fēng)、寒、濕三種致病因素侵襲肌理，從而造成局部的疼痛、腫脹、運(yùn)動障礙。在治療過程中運(yùn)用祛風(fēng)散寒、溫通經(jīng)脈、活血止痛等方法，往往能達(dá)到藥到病除的效果。本研究自2019年5月—2019年11月研究溫經(jīng)通絡(luò)湯對膝骨關(guān)節(jié)炎小鼠的治療作用及其作用機(jī)制是否與血管侵襲即VEGF信號通路有關(guān)。旨在觀察溫經(jīng)通絡(luò)湯對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)和缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的影響，以進(jìn)一步明確其對KOA的治療作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

SPF級健康3月齡C57BL/6雄性小鼠30只，體質(zhì)量(20±2)g，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，許可證號SCXK(蘇)2012-0008，合格證號：201831343。在無特定病原體(SPF級)條件下常規(guī)喂養(yǎng)，12 h/12 h光暗交替，恒溫恒濕，標(biāo)準(zhǔn)化顆粒飼料、飲用水、墊料及其他相關(guān)物品均經(jīng)滅菌處理。本實(shí)驗(yàn)方案由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審核(201904A009)。

1.2 分組

將小鼠在20 ℃～26 ℃(SPF級)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，依據(jù)隨機(jī)分配原則分為5組，每組6只。分別為假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)、溫經(jīng)通絡(luò)湯高劑量組(C組)、溫經(jīng)通絡(luò)湯低劑量組(D組)和陽性藥(美洛昔康)組(E組)。

1.3 主要試劑及儀器設(shè)備

蘇木素染液、伊紅染液(中國，南京建成公司，D005)；VEGF、MMP-13、HIF-1α ELISA檢測試劑盒(鎮(zhèn)江愛必夢生物科技有限公司)；石蠟切片機(jī)(Leica,RM2245)；組織包埋機(jī)(Leica，EG1150H/C)；免疫組化筆(中國，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，KGSP10)；倒置生物顯微鏡(CKX31，Olympus，日本)。

1.4 藥物制備及干預(yù)處理

依據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》劑量估換計(jì)算公式：dB=dA×KB/KA，將成人每日服藥量折算為小鼠每日服藥量(溫經(jīng)通絡(luò)湯組成：制附子、桂枝、熟地黃、土茯苓、澤瀉、陳皮、膽南星、延胡索、全蝎、蜈蚣、懷牛膝和甘草。均由江蘇省中醫(yī)院藥劑科提供)。將溫經(jīng)通絡(luò)湯煎煮濃縮至2 g/mL，每只小鼠每日灌胃0.2 mL。將美洛昔康膠囊內(nèi)粉末溶于水，并定容為10 mL/(kg·d)。造模成功后A組與B組分別予以10 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃，C組(藥物濃度為2 g/mL)與D組(藥物濃度為1 g/mL)分別予以10 mL/(kg·d)溫經(jīng)通絡(luò)湯灌胃，E組予以10 mL/(kg·d)美洛昔康水溶液灌胃，持續(xù)2周。

2 檢測指標(biāo)與方法

2.1 模型建立

對于A組的C57BL/6小鼠，打開關(guān)節(jié)腔后直接縫合。其余各組予以ACLT法建立膝骨關(guān)節(jié)炎模型：實(shí)驗(yàn)小鼠予以戊巴比妥鈉麻醉后取仰臥位，于膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)面做約7 mm縱向切口，眼科剪逐層玻璃皮下組織，膝關(guān)節(jié)伸直位時將臏前韌帶推向外側(cè)脫位，脫位后屈曲膝關(guān)節(jié)，打開關(guān)節(jié)囊，于關(guān)節(jié)腔內(nèi)準(zhǔn)確定位前交叉韌帶，體式顯微鏡下用顯微剪離斷前交叉韌帶，止血并關(guān)閉手術(shù)創(chuàng)口。術(shù)后連續(xù)3 d青霉素0.4 MU/d肌注，預(yù)防感染。置于標(biāo)準(zhǔn)動物飼養(yǎng)籠中允許其自由活動及進(jìn)食，無特殊干預(yù)下繼續(xù)飼養(yǎng)4周。

2.2 組織學(xué)觀察

造模成功及給藥干預(yù)結(jié)束后，解剖各組實(shí)驗(yàn)小鼠的右側(cè)膝關(guān)節(jié)。保留部分股骨及脛骨平臺，取下完整的膝關(guān)節(jié)后4%多聚甲醛固定，脫鈣液脫鈣，二甲苯透明后制作厚度為5 μm的石蠟切片，蘇木精-伊紅染色(HE染色)，生物顯微鏡下觀察后進(jìn)行Mankin's評分。

2.3 免疫組織化學(xué)

保留部分股骨及脛骨平臺，取下完整的膝關(guān)節(jié)后4%多聚甲醛固定，脫鈣液脫鈣，二甲苯透明后制作厚度為5 μm的石蠟切片。將放有切片的耐高溫塑料染色架放入盛有抗原修復(fù)緩沖液的染色盒內(nèi)，放至微波爐中，中高火檔至加熱10 min，將染色盒取出浸入流水中。自然冷卻后用PBS浸洗3次。每張切片滴加2滴3%H2O2-甲醇溶液，室溫(15 ℃～25 ℃)封閉10 min。PBS浸洗3 min×3次，滴加1%BSA 50～100 μL,室溫孵育20 min。甩去，不洗。滴加一抗50～100 μL，4 ℃過夜。PBS浸洗3 min×3次。滴加增強(qiáng)劑50 μL，室溫濕盒孵育20 min。PBS浸洗3 min×3次。

一抗二抗反應(yīng)：滴加通用型鼠/兔聚合物50 μL，室溫37 ℃濕盒孵育20 min。PBS浸洗3 min×3次。每張片子加2滴新鮮配制的DAB溶液。鏡下觀察染色深淺，染好立即終止,用自來水輕柔沖洗15 min用蒸餾水終止顯色反應(yīng)。將切片放入蘇木素染液，染色10 min，用蒸餾水沖洗干凈。如染色過深，可用0.1% HCl分化，自來水沖洗后返藍(lán)。分別用70%乙醇中浸泡5 min；85%乙醇中浸泡5 min；95%乙醇中浸泡5 min；無水乙醇乙醇中浸泡5 min。用二甲苯浸泡10 min，更換二甲苯后再浸泡10 min。在切片上加中性樹膠，加蓋玻片。光學(xué)顯微鏡下觀察組織細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況，取3個高表達(dá)區(qū)域拍照保存(所有圖片均400倍拍攝)。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附檢測

造模成功及給藥干預(yù)結(jié)束后，眼球取血1.5 mL，靜置后離心(4 ℃，2 000 r/min，30 min)，吸取上層血清，并分裝于離心管中，-80 ℃保存。按照酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒使用說明書檢測各組血清中VEGF，MMP13的含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 軟骨組織學(xué)觀察及Mankin's評分

假手術(shù)組(A組)的小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，細(xì)胞排列規(guī)則，潮線完整，結(jié)構(gòu)清晰，染色正常；模型組(B組)的小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面不完整，可見部分軟骨脫落，未見清晰的軟骨結(jié)構(gòu)及潮線；高劑量組(C組)小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨面光滑完整，局部深染，無軟骨斷裂及剝脫，潮線連續(xù)度尚可；低劑量組(D組)小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面連續(xù)，軟骨結(jié)構(gòu)較清晰，染色尚可，潮線模糊，有輕度失染；陽性藥(美洛昔康)組(E組)小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑度尚可，局部修復(fù)，未見明顯軟骨斷裂及剝脫，重度深染，潮線模糊。見圖1。

圖1 溫經(jīng)通絡(luò)湯干預(yù)2周后各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨HE染色(×400)

膝關(guān)節(jié)軟骨的Mankin's評分顯示：與假手術(shù)組相比，其余各組的評分均明顯升高(P<0.05)，與模型組相比，高劑量組、低劑量組、陽性藥組的評分則明顯下降(P<0.05)。高劑量組的評分低于低劑量組和陽性藥組(P<0.05)，低劑量組與陽性藥組的評分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果見表1。

表1 各組膝關(guān)節(jié)軟骨的Mankin's評分比較分)

3.2 ELISA檢測血清中VEGF、MMP-13表達(dá)

ELISA檢測結(jié)果顯示，造模成功并干預(yù)2周后，與假手術(shù)組相比，其余各組的小鼠血清中VEGF及MMP-13表達(dá)均有明顯升高(P<0.05)，其中模型組小鼠血清中VEGF及MMP-13的表達(dá)最高，高劑量組、低劑量組、陽性藥組與模型組相比均有下降(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組血清中VEGF、MMP-13表達(dá)情況比較

3.3 免疫組織化學(xué)檢測各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中的VEGF, MMP-13及HIF-1α的表達(dá)

造模成功并干預(yù)2周后，高劑量組、低劑量組和陽性藥組中小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中的VEGF表達(dá)相較于模型組組均有明顯下降，其中陽性藥組的表達(dá)最低，接近于假手術(shù)組的水平。低劑量組、高劑量組和陽性藥組的VEGF表達(dá)呈遞減趨勢。該部分實(shí)驗(yàn)證實(shí)了中藥復(fù)方溫經(jīng)通絡(luò)湯在治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的過程中，對膝關(guān)節(jié)中存在的血管新生與侵襲的確存在抑制作用。其可通過抑制膝關(guān)節(jié)中VEGF的表達(dá)，從而減慢膝關(guān)節(jié)內(nèi)骨-軟骨交界處的血管新生和向軟骨內(nèi)侵襲的過程。見圖2、圖3和表3。

圖2 免疫組化檢測各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中VEGF的表達(dá)(×400)

表3 各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中的VEGF,MMP-13及HIF-1α表達(dá)比較

圖3 小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中的VEGF表達(dá)比較

造模成功并干預(yù)2周后，高劑量組、低劑量組及陽性藥組中小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中的MMP-13表達(dá)相較于模型組均有明顯下降，其中陽性藥組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中的MMP-13表達(dá)最低，接近于假手術(shù)組的水平。低劑量組、高劑量組、陽性藥組的MMP-13表達(dá)呈遞減趨勢。該部分實(shí)驗(yàn)表明，中藥復(fù)方溫經(jīng)通絡(luò)湯在治療KOA的過程中，可有效降低MMP-13的表達(dá)，MMP-13不僅可以降解軟骨中的Ⅱ型膠原蛋白，還可以降解軟骨中的蛋白多糖，IV型和X型膠原蛋白，骨黏連蛋白和基底膜蛋白聚糖，其在KOA中扮演著重要角色[2]。而溫經(jīng)通絡(luò)湯可以通過抑制MMP-13的表達(dá)，從而達(dá)到維持膝關(guān)節(jié)內(nèi)生理環(huán)境的平衡，進(jìn)一步延緩膝關(guān)節(jié)內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨的退變。見圖4、圖5和表3。

圖4 免疫組化檢測各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中MMP-13的表達(dá)(×400)

圖5 小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中的MMP-13表達(dá)比較

造模成功并干預(yù)2周后，模型組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中的HIF-1α含量相較于假手術(shù)組有明顯升高(P<0.01)，高劑量組、低劑量組及陽性藥組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中的HIF-1α含量均高于假手術(shù)組且低于模型組(P<0.05)。低劑量組、高劑量組及陽性藥組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中的HIF-1α含量呈遞減趨勢(P<0.05)。該部分實(shí)驗(yàn)證實(shí)，中藥復(fù)方溫經(jīng)通絡(luò)湯在治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎過程中，可有效抑制關(guān)節(jié)表面軟骨內(nèi)HIF-1α的表達(dá)，由于VEGF是HIF-1α調(diào)節(jié)的靶基因，所以溫經(jīng)通絡(luò)湯可通過抑制HIF1α的表達(dá)，從而達(dá)到減緩血管新生的目的。見圖6、圖7和表3。

圖6 小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中的HIF-1α表達(dá)比較

圖7 免疫組化檢測各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中HIF-1α的表達(dá)(×400)

4 討論

溫經(jīng)通絡(luò)湯是黃桂成教授結(jié)合數(shù)十年臨床經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)過不斷調(diào)整、優(yōu)化后總結(jié)出的經(jīng)驗(yàn)方。方中附子、桂枝溫經(jīng)散寒、通絡(luò)止痛；熟地黃養(yǎng)血滋陰、生精益髓；土茯苓、澤瀉利水除濕解毒、通利關(guān)節(jié)；陳皮化痰理氣；膽南星熄風(fēng)定痙；延胡索活血行氣止痛；全蝎、蜈蚣搜風(fēng)通絡(luò)、熄風(fēng)止痛、解毒散結(jié)；懷牛膝引藥下行，補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨；甘草調(diào)和諸藥。此方針對膝骨關(guān)節(jié)炎的致病因素，從風(fēng)、寒、濕三邪入手，以祛風(fēng)、散寒、化濕等為治療原則，以溫經(jīng)散寒，搜風(fēng)通絡(luò)為治療方法，在臨床應(yīng)用中取得了立竿見影的效果。

膝骨關(guān)節(jié)炎屬于骨痹范疇，如《素問·靈樞》[3]曰：“痹在于骨則重……在于筋則屈不伸?！毕ス顷P(guān)節(jié)炎是影響中老年人群工作生活的常見病癥，其主要癥狀包括局部疼痛，活動受限，關(guān)節(jié)腫脹、變形等。該疾病的發(fā)生發(fā)展過程中伴隨著軟骨的破損、增生、缺失等一系列的病理改變[4]，在發(fā)生病變的軟骨中血管侵襲起到了不可忽視的作用，新生血管可進(jìn)一步加重軟骨結(jié)構(gòu)的破壞，而血管生長因子(VEGF)則起到了促進(jìn)血管新生的作用，因此通過抑制VEGF的表達(dá)，可有效減緩軟骨內(nèi)血管侵襲的速度，從而達(dá)到保護(hù)軟骨形態(tài)，減輕膝骨關(guān)節(jié)炎癥狀的效果[5]。骨關(guān)節(jié)炎機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，血管侵襲是軟骨破壞的始動環(huán)節(jié)，早期抑制血管侵襲可以阻止骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展[6]。軟骨組織受刺激分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),早期誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖并向軟骨區(qū)定向移動，軟骨組織受刺激分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)等蛋白酶，進(jìn)一步為血管侵襲開辟組織間隙[7]。VEGF可能是炎癥新生血管的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移和刺激血管生成[8]。Cécile Lambert等[9]研究膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的滑膜組織標(biāo)本16例，通過組織學(xué)和免疫組化實(shí)驗(yàn)，滑膜細(xì)胞分離培養(yǎng)、DNA分析以及IL-6、IL-8、VEGF、TSP-1和VEGI的免疫測定，對不同程度的滑膜血管生成和炎癥關(guān)系進(jìn)行研究。免疫組化研究顯示KOA滑膜的內(nèi)皮細(xì)胞密度和VEGF免疫反應(yīng)性增加，對應(yīng)著炎癥級別和巨噬細(xì)胞浸潤增加。TSP-1作為血管生成抑制劑，過表達(dá)會降低炎癥和血液滑膜血管密度。巨噬細(xì)胞在內(nèi)皮的遷移是血管生成的關(guān)鍵步驟之一。巨噬細(xì)胞通過促血管生成因子和細(xì)胞外基質(zhì)重塑促進(jìn)血管生成。Tibesku等[10]建立了前交叉韌帶(anterior cruciate ligament, ACL)切斷的兔膝關(guān)節(jié)KOA模型，提取關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行組織學(xué)和免疫組化研究。實(shí)驗(yàn)顯示KOA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)VEGF 高表達(dá)。Lambert 等[11]采集了接受全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)(total Knee Arthroplasty, TKA)的KOA 患者的滑膜組織，檢測VEGF 在內(nèi)的多種細(xì)胞因子水平。實(shí)驗(yàn)證實(shí)VEGF 和 KOA 的發(fā)生及進(jìn)程密切相關(guān)。Saetan 等[12]和Hoff 等[13]采集KOA 患者的組織液：血漿、膝關(guān)節(jié)液、滑膜和軟骨，并檢測各種細(xì)胞因子水平。實(shí)驗(yàn)證實(shí)關(guān)節(jié)液和滑膜組織中，包括VEGF在內(nèi)的多種 PIC 水平相較于血漿顯著升高。Chen等[14]將大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以單層培養(yǎng)，通過RT-PCR和WB實(shí)驗(yàn)，表明VEGF可能通過抑制聚集蛋白聚糖和II型膠原的合成和表達(dá)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退化。VEGF 是血管生成的重要參與者，是血管內(nèi)皮細(xì)胞形成的啟動者。VEGF 的表達(dá)受多個基因的調(diào)控，HIF-1α是調(diào)控VEGF表達(dá)最主要的基因[13]。

通過以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出溫經(jīng)通絡(luò)湯可有效抑制HIF-1α的表達(dá)，從而進(jìn)一步調(diào)控VEGF的表達(dá)，延緩血管侵襲軟骨的進(jìn)程，以達(dá)到減輕炎癥反應(yīng)，減緩軟骨退化，修復(fù)軟骨缺損，維持軟骨完整性，改善關(guān)節(jié)生理功能的目的。