王鑫元，國(guó) 強(qiáng)，常哲瀚，4，曹曉宇

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院2018級(jí)在讀研究生，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；3.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院2019級(jí)在讀研究生；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)低氧轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

胃癌是我國(guó)發(fā)病率與死亡率居前5位的消化道惡性腫瘤之一[1]，研究表明其發(fā)病率為70/10萬(wàn)[2]。目前胃癌根治術(shù)聯(lián)合新輔助化療是最主要的治療手段，且此治療方法相對(duì)成熟[3]，能夠提高胃癌患者的五年生存率。但部分前往醫(yī)院就診的患者已處于進(jìn)展期或伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，錯(cuò)失了最佳手術(shù)時(shí)間，所以全身化療藥物治療是中晚期胃癌的主要治療手段[4]。奧沙利鉑是近年投入臨床使用的第3代鉑類藥物，可與DNA相結(jié)合，具有廣譜的抗癌活性，且與第二代鉑類藥物無(wú)交叉耐藥的情況出現(xiàn)，其血液學(xué)毒性、胃腸道和肝腎功能的副作用低于第二代，出現(xiàn)周?chē)窠?jīng)炎的患者在停藥后也可逐漸恢復(fù)[5-6]。

P53是人體內(nèi)最常見(jiàn)的抑癌基因，也是近些年研究最廣泛的基因之一。P53蛋白可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，在下一個(gè)周期起到修復(fù)DNA的作用，抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展[7]。microRNA(微小RNA，miRNA)是一類存在于真核生物中通過(guò)降解靶信使RNA來(lái)調(diào)控的小分子RNA，其表達(dá)影響胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[8]。miR-34a是miR-34家族的一員，其陽(yáng)性表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)[9]。miRNA作為P53的下游靶基因，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引起細(xì)胞周期阻滯，從而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲[10]。本研究構(gòu)建胃癌細(xì)胞的加藥模型和轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)miR-34a模型，Western blot和Real-time PCR技術(shù)探究P53、miR-34a兩者之間的關(guān)系，明確奧沙利鉑對(duì)P53和miR-34a在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)，為中晚期胃癌的治療提供新的方案與臨床治療思路。

1 材料與方法

1.1材料 BGC-823細(xì)胞購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，RPMI Medium 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(0.25 %)、PBS緩沖液、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白酶抑制劑(PMSF)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、ECL Plus超敏發(fā)光液、4×蛋白上樣緩沖液(含DTT)、10×電泳緩沖液、10×TBST緩沖液均購(gòu)自于北京索萊寶科技有限公司，胎牛血清(Fetal Bovine Serum)購(gòu)自于杭州四季青生物工程材料有限公司，注射用奧沙利鉑購(gòu)自于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，Opti-MEM?I Reduced Serum Medium、Lipofectamine 2000均購(gòu)自于賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒(CCK-8)購(gòu)自于大連美侖生物技術(shù)有限公司，M221 Direct-load Color Prestained Protein Marker購(gòu)自于北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司，兔單克隆P53 抗體(#9282)、兔單克隆β-actin (13E5)抗體(#4970)均購(gòu)自于Cell Signaling Technology公司，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，RNA抽提試劑盒、miRNA熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自于上海吉瑪基因有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 用含10 % FBS的 RPMI Medium 1640培養(yǎng)基，加入青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(1 mg/mL)，在37 ℃、5 % CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中在100 mm培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)胃癌BGC-823細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞密度達(dá)85 %～90 %進(jìn)行細(xì)胞傳代，每盤(pán)按照1∶2的比例進(jìn)行分盤(pán)接種。

1.2.2細(xì)胞加藥 在37 ℃、5 % CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞密度達(dá)80 %左右加入終濃度為13 μg/cm2的注射用奧沙利鉑，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)12 h、24 h，分別記為12 h組和24 h組。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞種植在96孔板中常規(guī)過(guò)夜培養(yǎng)，分別在不含血清的25 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中稀釋5 pmol的miR-34a和空載熒光質(zhì)粒。取25 μL不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)基中加入0.5 μL Lipofectamine 2000，混勻后室溫孵育5 min。將稀釋后的miR-34a、NC熒光質(zhì)粒與稀釋后的Lipofectamine 2000混合，混勻后室溫孵育5 min。棄掉96孔板中的原培養(yǎng)基加入混合液放入培養(yǎng)箱中孵育24～48 h，并在熒光倒置顯微鏡下觀察。將轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞分別記為+34a組與NC組。

1.2.4CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 制備細(xì)胞懸液接種在96孔板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)基，在37 ℃、5 % CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。向孔內(nèi)加入濃度為13 μg/cm2的注射用奧沙利鉑，并設(shè)置一個(gè)空白孔，分別培養(yǎng)12 h、24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板充分混勻，在培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)2 h后，在波長(zhǎng)為490 nm下分別檢測(cè)各孔吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞活力。C組正常培養(yǎng)細(xì)胞，未做任何處理。

1.2.5Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白。使用BCA試劑盒測(cè)量蛋白液濃度，使用SDS-PAGE凝膠制備試劑盒分別配置10 %的分離膠與5 %的濃縮膠，按照上樣體積上樣,進(jìn)行電泳分離并電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上并過(guò)夜轉(zhuǎn)膜，5 %脫脂牛奶進(jìn)行封閉。使用一抗(P53、β-actin)按照1∶1 000稀釋后在4 ℃搖床孵育過(guò)夜。對(duì)應(yīng)二抗按照1∶1 000稀釋后在室溫孵育2 h，使用ECL超敏發(fā)光液并在化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)蛋白信號(hào)。

1.2.6Real-time PCR檢測(cè)m RNA表達(dá) 收集各組細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA。使用Nano Drop2000檢測(cè)各組RNA濃度，應(yīng)用Hairpin-itTM MicroRNAs Quantitation PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒將microRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-34a的表達(dá)情況。使用通用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將P53 mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix檢測(cè)P53 mRNA的表達(dá)情況，使用2ˉΔΔCT計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 real time引物序列

2 結(jié)果

2.1奧沙利鉑對(duì)BGC-823細(xì)胞活力的影響 CCK-8結(jié)果顯示，與C組相比，加藥濃度13 μg/cm2的12 h組與24 h組細(xì)胞活力均呈下降趨勢(shì)(P<0.05)，24 h組比12 h組細(xì)胞活力下降更顯著(P<0.05)。NC組與C組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，+34a組細(xì)胞活力較C組表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2奧沙利鉑及過(guò)表達(dá)miR-34a對(duì)BGC-823細(xì)胞P53 mRNA表達(dá)水平的影響 P53 mRNA的表達(dá)水平在12 h無(wú)明顯變化，與C組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，24 h P53 mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。NC組P53 mRNA的表達(dá)水平增加，但與C組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，+34a組較C組表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3奧沙利鉑及過(guò)表達(dá)miR-34a對(duì)BGC-823細(xì)胞P53蛋白表達(dá)水平的影響 P53的蛋白表達(dá)水平在加藥12 h與C組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，24 h P53表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。NC組與C組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，過(guò)表達(dá)34a組P53蛋白表達(dá)量較C組表達(dá)呈上升趨勢(shì)(P<0.05)。

3 討論

胃癌是我國(guó)發(fā)病率最高的消化道惡性腫瘤，并且患者的預(yù)后較差，早期診斷與治療能夠顯著改善患者預(yù)后并提高患者的5年生存率[11]。奧沙利鉑作為第3代鉑類藥物，具有較高的抗腫瘤活性，許多基礎(chǔ)研究與臨床試驗(yàn)已充分證明單用或與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用均有明顯的療效[12-13]。目前臨床上使用的化療方案有XELOX、FOLFOX等。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在加入13 μg/cm2的奧沙利鉑后12 h和24 h，胃癌細(xì)胞BGC-823活力明顯受到抑制，本結(jié)果與之前相關(guān)研究相符[14]。

miRNA是一類非編碼的小分子單鏈RNA，長(zhǎng)度一般在19～24 nt，多由單鏈RNA的前體經(jīng)過(guò)加工后生成[15]。miR-34a不僅與胃癌的發(fā)生有關(guān)，而且與胃癌的增殖、進(jìn)展、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16]。我們的結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-34a組的胃癌細(xì)胞BGC-823與C組和NC組相比細(xì)胞活力呈下降趨勢(shì)。

P53是公認(rèn)的抑癌基因，位于人體內(nèi)染色體17p13位置處。野生型P53參與DNA的修復(fù)，抑制癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡，影響細(xì)胞周期、血管形成等有關(guān)[17]。結(jié)果顯示，在加入奧沙利鉑24 h后，胃癌細(xì)胞BGC-823的P53 mRNA和P53蛋白表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，表明在加入奧沙利鉑后能夠上調(diào)P53的表達(dá)，從而起到抑制胃癌細(xì)胞的增殖、發(fā)展，降低細(xì)胞活力的作用。有研究研究表明，P53能夠誘導(dǎo)多種microRNA的表達(dá)，其中P53對(duì)于誘導(dǎo)miR-34a的作用最明顯[18]。miR-34a可誘導(dǎo)P53表達(dá)上調(diào)，起到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制其發(fā)展的作用[19]。我們發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-34a組的P53在mRNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量均表達(dá)上調(diào)，表明過(guò)表達(dá)miR-34a作為P53的下游靶基因，可誘導(dǎo)P53的表達(dá)上調(diào)，與上述研究結(jié)論相符。

綜上所述，奧沙利鉑可能通過(guò)激活miR-34a，誘導(dǎo)上游的P53基因表達(dá)，起到促進(jìn)胃癌細(xì)胞BGC-823凋亡、減緩腫瘤的浸潤(rùn)與淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，以有效地增加中晚期患者的五年存活率，為奧沙利鉑治療中晚期胃癌的患者提供新的治療方案，并為相關(guān)耐藥機(jī)理的研究提供新的研究思路。