柯來順 涂燕芬 林慶金 劉華斌 肖雪蓮

摘要?目的：探討牛蒡子苷元對阿爾茨海默病體外模型β淀粉樣肽25-35（Aβ25-35）誘導PC12細胞凋亡和氧化損傷的影響及機制。方法：將PC12細胞分成對照組、模型組（Aβ25-35處理）、ATG-L組（2 μmol/L牛蒡子苷元和Aβ25-35處理）、ATG-M組（4 μmol/L牛蒡子苷元和Aβ25-35處理）、ATG-H組（8 μmol/L牛蒡子苷元和Aβ25-35處理）、ATG-H+LY29400組（AKT信號抑制劑LY29400、8 μmol/L牛蒡子苷元和Aβ25-35處理）。以流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡變化，黃嘌呤氧化法檢測超氧化物歧化酶（SOD）含量，Western Blotting法檢測磷酸化的蛋白激酶B（p-AKT）蛋白表達。結(jié)果：ATG-L組、ATG-M組、ATG-H組p-AKT/AKT表達量以及SOD含量高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）;ATG-L組、ATG-M組、ATG-H組細胞凋亡率低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）;ATG-H+LY29400組p-AKT/AKT表達量以及SOD含量低于ATG-H組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）;ATG-H+LY29400組細胞凋亡率高于ATG-H組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。結(jié)論：牛蒡子苷元通過激活AKT信號通路抑制阿爾茨海默病體外模型Aβ25-35誘導PC12細胞凋亡和氧化損傷。

關(guān)鍵詞?牛蒡子苷元;PC12細胞;阿爾茨海默病;β淀粉樣肽25-35;AKT信號;凋亡;氧化損傷;增殖

Abstract?Objective：To investigate the effect and its mechanis of arctigenin on the apoptosis and oxidative damage of PC12 cells induced by amyloid beta 25-35（Aβ25-35）in an in vitro model of Alzheimer′s disease.Methods：PC12 cells were divided into a control group，a model group （Aβ25-35 treatment），a ATG-L group （2 μmol/L arctigenin and Aβ25-35 treatment），a ATG-M group （4 μmol/L arctigenin and Aβ25-35 treatment），a ATG-H group （8 μmol/L arctigenin and Aβ25-35 treatment），and a ATG-H+LY29400 group （AKT signal inhibitor LY29400，8 μmol/L arctigenin and Aβ25-35 treatment）.Flow cytometry was used to detect cell apoptosis changes.Xanthine oxidation method was used to detect superoxide dismutase （SOD） content.The expression of Phosphorylated protein kinase B （p-AKT） protein in cells was detected with Western Blotting method.Results：P-AKT/AKT expression and SOD content in the ATG-L，ATG-M，ATG-H group were higher than those in the Model group，and the differences were statistically significant （Ps<0.05）; The apoptosis rate of the ATG-L，ATG-M，ATG-H group were lower than those of the Model group，and the difference was statistically significant （Ps<0.05）; The p-AKT/AKT，SOD levels in the ATG-H+LY29400 group were lower than those in the ATG-L，ATG-M and ATG-H group，and the differences were statistically significant （Ps<0.05）; The apoptosis rate in the ATG-H+LY29400 group were higher than those in the ATG-H group，and the differences were statistically significant （Ps<0.05）.Conclusion：Arctigenin can inhibit the apoptosis and oxidative damage of PC12 cells induced by Aβ25-35 in an in vitro model of Alzheimer′s disease by activating the AKT signaling pathway.

Keywords?Arctigenin; PC12 cells; Alzheimer′s disease; Aβ25-35; AKT signal; Apoptosis; Oxidative damage; Proliferation

中圖分類號：R285;R745.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.22.010

阿爾茨海默病是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，也是常見的老年疾病之一，對于阿爾茨海默病發(fā)病機制，有氧化應(yīng)激學說、瀑布假說、膽堿能學說、瀑布假說等多種學說[1]。β淀粉樣肽（Amyloid Beta，Aβ）沉積誘導神經(jīng)細胞損傷，促進神經(jīng)功能障礙[2]。牛蒡子苷元是從中藥牛蒡子中提取出來的活性成分，具有抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等作用，對腫瘤、糖尿病等有治療功效[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，牛蒡子苷元可改善神經(jīng)功能，牛蒡子苷元處理可改善乙醇誘導的PC12細胞損傷，減少細胞凋亡[5]。牛蒡子苷元治療后的阿爾茨海默病小鼠模型記憶功能明顯改善，衰老斑塊減少[6]。目前尚未發(fā)現(xiàn)牛蒡子苷元在阿爾茨海默病體外PC12細胞模型中的作用研究。已經(jīng)有研究表明，牛蒡子苷元發(fā)揮作用與信號通路如AKT等有關(guān)。AKT信號在組織中廣泛表達，具有調(diào)控細胞生長、凋亡、自噬、炎癥、氧化平衡等作用[7-8]。有研究顯示，阿爾茨海默病中AKT信號通路激活水平降低，而激活AKT可改善神經(jīng)損傷[9]。本實驗以Aβ25-35誘導PC12細胞，體外構(gòu)建阿爾茨海默病細胞模型，探討牛蒡子苷元對阿爾茨海默病細胞模型凋亡和氧化損傷的影響及機制，為牛蒡子苷元治療阿爾茨海默病的臨床使用提供參考。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?細胞?PC12細胞，貨號iCell-r026，由賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司提供。

1.1.2?藥物?牛蒡子苷元，規(guī)格：100 mg，批號：D297801，純度：≥98.0%，國家標準物質(zhì)資源平臺生產(chǎn)。

1.1.3?試劑與儀器?AKT抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab8805），Bax抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab32503）;Bcl-2抗體（Santa Cruz Biotechnology公司，美國，貨號：sc-7382），p-AKT抗體（Cell Signaling Technology公司，美國，貨號：9271），Aβ25-35（Sigma公司，美國，貨號：A4559-250UG）;SOD檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：BC0170）;GSH-Px檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，貨號：A005-1-2）;MDA檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，貨號：S0131S）;AKT信號抑制劑LY29400（medchemexpress公司，美國，貨號：LY29400），酶標儀（北京悅昌行科技有限公司，型號：SpectraMax iD5），流式細胞儀（貝克曼庫爾特公司，美國，型號：CytoFLEX），倒置顯微鏡（上海蔡康光學儀器有限公司，型號：XSP-11CD）。

1.2?方法

1.2.1?分組與給藥方法?PC12細胞分成對照組、模型組、ATG-L組、ATG-M組、ATG-H組、ATG-H+LY29400組，分組處理方法如下：1）對照組：按照常規(guī)方法培養(yǎng);2）模型組：用含有20 μmol/L的Aβ25-35細胞培養(yǎng)液刺激;3）ATG-L組：用含有2 μmol/L的牛蒡子苷元和20 μmol/L的Aβ25-35細胞培養(yǎng)液處理;4）ATG-M組：用含有4 μmol/L的牛蒡子苷元和20 μmol/L的Aβ25-35細胞培養(yǎng)液處理;5）ATG-H組：用含有8 μmol/L的牛蒡子苷元和20 μmol/L的Aβ25-35細胞培養(yǎng)液處理;6）ATG-H+LY29400組：用含有10 μmol/L的AKT信號抑制劑LY29400、8 μmol/L的牛蒡子苷元和20 μmol/L的Aβ25-35細胞培養(yǎng)液處理。

1.2.2?檢測指標與方法?1）CCK-8實驗分析細胞增殖[10]：在96孔細胞培養(yǎng)板中接種PC12細胞，接種密度為每孔4 000個細胞/100 μL，細胞培養(yǎng)過夜以后，分別在細胞中添加牛蒡子苷元，使其終濃度為0、2、4、8、16、32 μmol/L，或按照1.2.1中方法分組，每組設(shè)置3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在孔內(nèi)添加CCK-8，每個孔中添加10 μL，在37 ℃繼續(xù)反應(yīng)3 h。調(diào)整酶標儀波長為450 nm，檢測每個孔的OD值。OD值表示細胞增殖活性。2）流式細胞術(shù)測定細胞凋亡[11]：對照組、模型組、ATG-L組、ATG-M組、ATG-H組、ATG-H+LY29400組細胞培養(yǎng)24 h以后，每組設(shè)置3個復孔，在細胞中加入PBS洗滌2次，然后添加Binding Buffer配制成單細胞懸浮液，吸取5 μL的PI和Annexin V-FITC添加到細胞內(nèi)，放在室溫條件下結(jié)合15 min。用流式細胞儀檢測凋亡變化。3）Western Blotting方法檢測Bax、Bcl-2、p-AKT蛋白表達[12]：對照組、模型組、ATG-L組、ATG-M組、ATG-H組、ATG-H+LY29400組細胞培養(yǎng)24 h以后，每個檢測樣品設(shè)置3個復孔，在細胞中加入PBS溶液洗滌2次，添加含PMSF的RIPA，在冰上充分裂解。轉(zhuǎn)移至離心管中，4 ℃，10 000×g離心10 min。蛋白存在于上清液中。蛋白濃度測定用常規(guī)BCA方法，步驟根據(jù)試劑盒說明書進行。在蛋白樣品中加入5×Loading Buffer，于100 ℃煮沸5 min。本實驗選擇10%分離膠、5%濃縮膠進行電泳。每個泳道內(nèi)添加30 μg蛋白樣品。首先以70 V的電壓電泳，肉眼可見藍色染料電泳到分離膠時，此時將電壓調(diào)整為100 V，等到藍色染料已經(jīng)完全進入玻璃板底部邊緣1 mm處，關(guān)閉電源。將凝膠取出，切下分離膠。根據(jù)蛋白分子量大小裁剪NC膜。在冰上，100 V電壓條件下轉(zhuǎn)膜2 h。NC膜放在封閉液中，轉(zhuǎn)移到37 ℃條件下結(jié)合1 h。然后將NC膜放在一抗溶液中，Bax、Bcl-2一抗按照1∶800稀釋，p-AKT一抗按照1∶600稀釋，AKT一抗按照1∶1 000稀釋，在4 ℃過夜反應(yīng)。把NC膜放在1∶2 000稀釋以后的二抗中，轉(zhuǎn)移到37 ℃環(huán)境中結(jié)合1 h。滴加ECL顯色試劑。以GAPDH作為參照，根據(jù)條帶的灰度值對目的蛋白表達量進行半定量分析，目的蛋白表達量=目的條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。4）SOD、GSH-Px、MDA含量檢測[13]：對照組、模型組、ATG-L組、ATG-M組、ATG-H組、ATG-H+LY29400組細胞培養(yǎng)24 h以后，以SOD檢測試劑盒（黃嘌呤氧化法）、GSH-Px檢測試劑盒（比色）。

1.3?統(tǒng)計學方法?采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)分布及方差齊性，2組比較用t檢驗，多組差異比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2?結(jié)果

2.1?牛蒡子苷元對PC12細胞增殖影響?與0 μmol/L比較，2、4、8 μmol/L牛蒡子苷元處理后的PC12細胞增殖活性沒有變化，而16、32 μmol/L牛蒡子苷元處理后的PC12細胞增殖活性降低。見表1。選擇對PC12細胞增殖毒性無影響的2、4、8 μmol/L牛蒡子苷元做后續(xù)研究。

2.2?牛蒡子苷元對阿爾茨海默病PC12細胞增殖和凋亡的影響?模型組PC12細胞增殖活性降低，細胞凋亡率升高，細胞中Bax蛋白表達增多，Bcl-2蛋白表達減少，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。ATG-L組、ATG-M組、ATG-H組PC12細胞增殖活性逐漸升高，細胞凋亡率逐漸降低，細胞中Bax蛋白表達逐漸減少，Bcl-2蛋白表達逐漸增多，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1，表2。

2.3?牛蒡子苷元對阿爾茨海默病PC12細胞氧化損傷的影響?模型組PC12細胞SOD、GSH-Px含量降低，MDA含量升高，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。ATG-L組、ATG-M組、ATG-H組PC12細胞的SOD、GSH-Px含量逐漸升高，MDA含量逐漸降低，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。見表3。

2.4?牛蒡子苷元對阿爾茨海默病PC12細胞中AKT信號通路的激活作用?模型組PC12細胞p-AKT/AKT表達量降低，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。ATG-L組、ATG-M組、ATG-H組PC12細胞p-AKT/AKT表達量逐漸升高，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。見圖2和表4。

2.5?AKT信號通路抑制劑對牛蒡子苷元作用阿爾茨海默病PC12細胞增殖、凋亡和氧化損傷的影響?ATG-H+LY29400組PC12細胞增殖活性降低，細胞凋亡率升高，細胞中Bax蛋白表達增多，Bcl-2蛋白表達減少，p-AKT/AKT表達量減少，SOD、GSH-Px含量降低，MDA含量升高，與ATG-H組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖3，表5。

3?討論

阿爾茨海默病占全部老年癡呆的60%以上，記憶減退、人格變性、認知障礙等是阿爾茨海默病的臨床表現(xiàn)。Aβ沉積產(chǎn)生老年斑、神經(jīng)元丟失是阿爾茨海默病的典型病理特征，Aβ可誘導神經(jīng)細胞氧化損傷，促進細胞凋亡，造成神經(jīng)功能障礙[2]。細胞內(nèi)氧化應(yīng)激平衡與抗氧化酶活性有關(guān)，GSH-Px、SOD是常見的抗氧化酶，其活性降低可以誘導氧自由基積累，誘導脂質(zhì)發(fā)生過氧化，產(chǎn)生MDA，造成氧化損傷[14]。氧自由基還可以激活細胞凋亡途徑，加快細胞凋亡[15]。Bax和Bcl-2是Bcl-2蛋白家族成員，二者表達改變與細胞凋亡水平相關(guān)[16]。Bax在細胞凋亡過程中發(fā)揮促進作用，Bcl-2在細胞凋亡過程中發(fā)揮抑制作用，Bax和Bcl-2蛋白表達變化共同影響細胞凋亡[17]。本實驗結(jié)果表明，Aβ25-35處理后的PC12細胞凋亡率升高，細胞中Bax蛋白表達增多，Bcl-2蛋白表達減少，細胞增殖活性下降，GSH-Px、SOD含量降低，MDA含量升高，Aβ25-35誘導PC12細胞損傷，提示成功構(gòu)建了阿爾茨海默病體外細胞模型。

牛蒡子苷元是一種木脂素類化合物，可用于治療麻疹、風熱感冒，現(xiàn)代藥理學還證明牛蒡子苷元具有降血糖、抗菌、抗腫瘤等功效[18]。有實驗發(fā)現(xiàn)，牛蒡子苷元對阿爾茨海默病也具有改善功效，牛蒡子苷元治療后的阿爾茨海默病小鼠神經(jīng)記憶功能明顯改善[6-7]。本實驗結(jié)果顯示，牛蒡子苷元處理后的阿爾茨海默病PC12細胞增殖活性升高，細胞凋亡減少，細胞中Bax蛋白表達減少，Bcl-2蛋白表達增多，GSH-Px、SOD含量升高，MDA含量降低，牛蒡子苷元改善阿爾茨海默病PC12細胞氧化損傷，減少細胞凋亡，我們首次在體外阿爾茨海默病細胞模型中證明了牛蒡子苷元的作用，并且說明牛蒡子苷元可能是阿爾茨海默病的治療藥物。

牛蒡子苷元的藥理學作用廣泛，但其分子作用機制尚不明確。研究表明，牛蒡子苷元可通過調(diào)控細胞內(nèi)的信號通路發(fā)揮作用。牛蒡子苷元在改善阿爾茨海默病小鼠學習記憶障礙的同時可促進AKT磷酸化，牛蒡子苷元作用機制可能與AKT信號通路有關(guān)[7]。AKT是一個具有廣泛作用的信號轉(zhuǎn)導通路，參與細胞增殖、凋亡、分化、衰老、自噬等過程[19-21]。已知AKT信號在阿爾茨海默病中激活水平降低，而激活AKT信號可改善阿爾茨海默病進展[22]。本實驗表明，牛蒡子苷元提高了阿爾茨海默病PC12細胞中p-AKT磷酸化水平，并且AKT信號抑制劑可逆轉(zhuǎn)牛蒡子苷元對阿爾茨海默病PC12細胞增殖、凋亡和氧化損傷的作用，這進一步驗證了牛蒡子苷元可通過激活AKT信號影響阿爾茨海默病PC12細胞損傷，首次發(fā)現(xiàn)牛蒡子苷元影響阿爾茨海默病體外細胞模型凋亡和氧化損傷的機制與AKT信號有關(guān)。

綜上所述，牛蒡子苷元具有抗阿爾茨海默病作用，其可以通過激活AKT信號抑制阿爾茨海默病PC12細胞凋亡和氧化損傷，這為牛蒡子苷元治療阿爾茨海默病的臨床使用提供了理論支撐。以后實驗中會繼續(xù)分析牛蒡子苷元其他可能作用機制和具體分子靶向機制。

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（2021-09-01收稿?責任編輯：楊覺雄）