所元東 黃云超 黃永平 張立人 孫卓琛 李炫呈 周 晨 楊政鴻

云南省腫瘤醫(yī)院 昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院胸外一科,云南昆明 650118

全球大部分國家中，肺癌的發(fā)病率和死亡率均排在首位。據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告，有210萬例新肺癌病例和180萬例死亡，占癌癥死亡人數(shù)的近五分之一（18.4%）[1]。80%以上的患者為肺癌晚期（Ⅲ期、Ⅳ期），只能采用化療、放療和姑息療法等治療方法[2]。因此，全面了解肺癌的微環(huán)境、增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥以及復(fù)發(fā)等相關(guān)分子機(jī)制是治療肺癌的關(guān)鍵。體外模型是研究腫瘤分子機(jī)制和藥物篩選的重要工具，用于肺癌體外研究的模型主要包括二維細(xì)胞模型和動(dòng)物模型。二維細(xì)胞培養(yǎng)是通過細(xì)胞黏附在塑料或玻璃培養(yǎng)基等固體平面上形成的，具有可重復(fù)性高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在新型抗癌藥物的研發(fā)方面具有優(yōu)勢(shì)[3-4]。但是，與體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生存環(huán)境相比，忽視了氧氣、營養(yǎng)、藥物濃度梯度的影響，限制了細(xì)胞-細(xì)胞與細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的相互作用[4]。動(dòng)物模型也存在一定局限性，如缺乏人體內(nèi)復(fù)雜的分子轉(zhuǎn)化機(jī)制、腫瘤微環(huán)境（tumor environment，TME）與人體內(nèi)存在差異、生長速度快于原發(fā)腫瘤等。二維細(xì)胞培養(yǎng)模型和動(dòng)物模型的不足導(dǎo)致藥物研發(fā)具有較低的臨床轉(zhuǎn)化率，在三期臨床實(shí)驗(yàn)中顯示出療效的藥物，只有5%能應(yīng)用于臨床，造成較低臨床轉(zhuǎn)化的主要原因是沒有選擇合適的臨床前模型[5]。逐漸成熟的三維細(xì)胞培養(yǎng)（three-dimensional cell culture，3DCC）模型正好可以彌補(bǔ)二維細(xì)胞培養(yǎng)模型和動(dòng)物模型的劣勢(shì)，能較好地模擬人體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、分化和轉(zhuǎn)移，可以構(gòu)建類似體內(nèi)環(huán)境的TME，在抗癌藥物的開發(fā)和篩選、耐藥機(jī)制等方面具有較好的應(yīng)用前景。

3DCC在研究癌細(xì)胞的生長、增殖、分化、轉(zhuǎn)移及TME等方面顯現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。用于構(gòu)建三維細(xì)胞培養(yǎng)的方法越來越趨于成熟，如懸浮培養(yǎng)、微流體、基于支架的水凝膠以及磁流體和生物印刷等，各種方法已經(jīng)在相關(guān)研究中使用廣泛[6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)癌細(xì)胞的研究占到35%，接近所有細(xì)胞種類的三分之一[7]。截至目前，3DCC技術(shù)在乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌以及卵巢癌中已被廣泛應(yīng)用[4]。但應(yīng)用于肺癌相關(guān)的研究較少，本文擬對(duì)三維培養(yǎng)技術(shù)在肺癌研究中的應(yīng)用做一綜述，評(píng)價(jià)其應(yīng)用價(jià)值及優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于肺癌及其相關(guān)研究[7]。

1 肺癌細(xì)胞在二維培養(yǎng)與三維培養(yǎng)下的生物學(xué)行為差異

三維培養(yǎng)與二維培養(yǎng)在細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài)以及蛋白表達(dá)等方面具有明顯差異。非小細(xì)胞肺癌95D細(xì)胞在三維打印支架培養(yǎng)形成三維模型，在細(xì)胞形態(tài)上，細(xì)胞以大小不等的球形態(tài)分布在支架上，類似于肺內(nèi)彌散性轉(zhuǎn)移，還可觀察到分葉、毛刺、結(jié)節(jié)等形態(tài)學(xué)特征；而二維培養(yǎng)的同類型細(xì)胞在培養(yǎng)基板面上呈梭性展開，只有偽足形成[8-9]。王珊珊[10]比較了二維和三維培養(yǎng)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的差異，二維培養(yǎng)的A549貼壁生長，呈不規(guī)則狀，三維培養(yǎng)則呈球狀生長。

在增殖能力方面，培養(yǎng)初期三維培養(yǎng)細(xì)胞增殖速率明顯慢于二維培養(yǎng)，培養(yǎng)至8～9 d時(shí)，增殖速度加快，超過二維培養(yǎng)，整個(gè)過程中，三維培養(yǎng)可以保持更長的增殖時(shí)間[9]。將二維和三維培養(yǎng)的人肺腺癌A549分別接種在Scid裸鼠體內(nèi)，三維培養(yǎng)組小鼠腫瘤生長至1 cm所需時(shí)間明顯少于二維培養(yǎng)組，生長速度也快于二維培養(yǎng)組，接種20 d后腫瘤體積明顯大于二維培養(yǎng)組[11]。

在蛋白表達(dá)方面，三維培養(yǎng)中基質(zhì)金屬蛋白酶 -2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）蛋白高表達(dá)，明顯高于二維培養(yǎng)，可能是因?yàn)镸MP-2的分泌需要微環(huán)境的刺激，而二維培養(yǎng)中缺乏腫瘤微環(huán)境[9，12]。閆江濤等[8]也得出相似結(jié)論，三維共培養(yǎng)的非小細(xì)胞肺癌GLC-82細(xì)胞與人胚肺成纖維細(xì)胞可以明顯上調(diào)MMP-1、MMP-2、MMP-9等蛋白，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。因此，TME與腫瘤細(xì)胞間的相互作用在癌癥的侵襲、增殖、轉(zhuǎn)移及耐藥等研究中是不能忽視的。非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞系的3D聚集體，與二維培養(yǎng)的蛋白質(zhì)表達(dá)譜也存在明顯差異，但蛋白質(zhì)分子量與人體內(nèi)肺癌對(duì)應(yīng)蛋白是相匹配的。與二維培養(yǎng)相比，其中RET、MET、MEK1、CEACAM1、CEACAM3、CEACAM4、CEACAM7、CEACAM18-21表達(dá)增加；EGFR、BRAF、CEACAM6、CEACAM16表達(dá)下降；甚至還存在部分蛋白表達(dá)缺失，如 ROS、HER2、ALK、PIK3CA、CEACAM5和CEACAM8，這些蛋白在培養(yǎng)早期（4 d）呈低表達(dá)，在8 d后表達(dá)缺失[13]。肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞中的肺癌干細(xì)胞（lung cancer stem cells，LCSC）三維培養(yǎng)也發(fā)現(xiàn)FGF1和IGF1的表達(dá)和分泌水平顯著提高[14]。I型膠原（collagen I）在三維培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞KYSE510和KYSE140的也出現(xiàn)表達(dá)下降[15]。

可見，三維培養(yǎng)在細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài)方面均優(yōu)于二維培養(yǎng)，與體內(nèi)腫瘤生長方式更為接近。腫瘤微環(huán)境在腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移、化療耐藥等方面具有重要作用[16]，三維培養(yǎng)能夠模擬細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境（TME）之間的相互作用，可作為一種較優(yōu)的體外模型[17-18]。三維培養(yǎng)在不同的培養(yǎng)時(shí)期，蛋白表達(dá)的種類和量都會(huì)產(chǎn)生變化，可能與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)，這有助于研究腫瘤動(dòng)態(tài)發(fā)展和耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制。

2 三維培養(yǎng)技術(shù)在肺癌化療中的應(yīng)用

三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建的腫瘤細(xì)胞立體結(jié)構(gòu)，對(duì)于氧氣、營養(yǎng)、藥物等成分存在濃度梯度，細(xì)胞吸收藥物的方式和濃度更接近體內(nèi)，目前在藥物篩選和耐藥分析的研究中應(yīng)用廣泛。根據(jù)細(xì)胞種類可以將其分為單細(xì)胞三維培養(yǎng)和多細(xì)胞三維培養(yǎng)，單細(xì)胞培養(yǎng)主要用于研究藥物直接對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，多細(xì)胞培養(yǎng)除了上述作用外，還可以研究細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用對(duì)藥物的影響。

2.1 單細(xì)胞三維培養(yǎng)

人腺癌A549細(xì)胞形成的3D多層培養(yǎng)物，細(xì)胞呈層狀堆疊，是3D腫瘤球體的等效替代品，給予多西他賽、長春堿、阿糖胞苷和甲氨蝶呤四種藥物，治療后A549細(xì)胞活力均保持在50%以上，而二維培養(yǎng)的細(xì)胞活力均小于50%。前者還檢測(cè)到多重耐藥蛋白（MRP1/ABCC1），治療后其表達(dá)水平?jīng)]有變化，說明A549細(xì)胞對(duì)4種藥物沒有產(chǎn)生耐藥[19]。ROS1陽性的HCC78細(xì)胞系在吉蘭糖膠條件下進(jìn)行三維培養(yǎng)，使ROS1融合基因表達(dá)上調(diào)，分別給予克唑替尼和卡波替尼處理，結(jié)果顯示：克唑替尼對(duì)ROS1 WT和D2033 N突變的HCC78細(xì)胞的IC50降低了30倍和2倍，而對(duì)ROS1 G2032R突變的IC50反而超過了血漿峰值水平；卡波替尼對(duì)ROS1 WT和D2033 N突變的HCC78細(xì)胞的IC50均比峰值血漿水平低約20倍。使用三維培養(yǎng)ROS1陽性的HCC78細(xì)胞可以作為檢測(cè)ROS1突變和篩選其抑制劑的重要體外模型[20]。有研究利用肺癌患者的腫瘤組織培養(yǎng)形成3D腫瘤球體，與H1299腫瘤球體分別給予順鉑處理，培養(yǎng)72 h后IC50遠(yuǎn)高于二維培養(yǎng)[21]。肺癌細(xì)胞A549同樣給予順鉑處理，培養(yǎng)48 h以及72 h后，三維培養(yǎng)組的細(xì)胞存活率也顯著高于二維培養(yǎng)組，說明三維培養(yǎng)的細(xì)胞比二維培養(yǎng)具有更高的耐藥性[11]。需要注意的是，患者來源3D腫瘤球體，取材前需要注意其是否進(jìn)行過化療或靶向治療，否則腫瘤組織殘留的藥物可能會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。三維培養(yǎng)模型的藥物吸收模式類似于體內(nèi)細(xì)胞，腫瘤外部由于營養(yǎng)、氧氣等含量高，代謝活性高，藥物吸收濃度也隨之升高；腫瘤內(nèi)部由于營養(yǎng)、氧氣等不足，代謝廢物集聚，會(huì)引起細(xì)胞發(fā)生凋亡壞死，影響藥物的吸收，這種藥物分布差異會(huì)導(dǎo)致腫瘤的治療效果不佳。因此，三維培養(yǎng)相較于二維培養(yǎng)，能夠更有效地評(píng)估藥物效果和有效劑量，對(duì)于指導(dǎo)肺癌的藥物治療更具價(jià)值。

2.2 多細(xì)胞三維培養(yǎng)

有研究將NSCLC細(xì)胞系NCI-H157、肺癌來源的成纖維細(xì)胞和單核細(xì)胞以1∶1∶1的比例進(jìn)行3D共培養(yǎng)，經(jīng)紫杉醇處理，共培養(yǎng)物有80%的代謝活性，相較于單培養(yǎng)，對(duì)紫杉醇顯示出更低的敏感性。順鉑處理后，單培養(yǎng)和共培養(yǎng)的代謝活性沒有明顯差異。根據(jù)順鉑的作用機(jī)制，其不受TME的影響，可以引起細(xì)胞普遍凋亡[22]。則造成兩種藥物處理結(jié)果不同的原因可能是肺癌來源的成纖維細(xì)胞和單核細(xì)胞改變了癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。成纖維細(xì)胞和單核細(xì)胞來源于肺癌的微環(huán)境，說明TME能夠影響藥物對(duì)細(xì)胞的治療效果，是在藥物篩選和耐藥分析中不能忽視的重要因素之一。

3 三維培養(yǎng)技術(shù)在肺癌放療中的應(yīng)用

肺癌放射治療中，腫瘤組織的氧含量及微環(huán)境改變是影響放療效果的重要因素。相關(guān)研究表明氧氣分壓低于25～30 mmHg時(shí)，放療敏感性會(huì)迅速降低[23-24]。三維培養(yǎng)模型，相較于其他體外模型，在模擬氧氣、營養(yǎng)等梯度具有巨大優(yōu)勢(shì)。

將A549細(xì)胞嵌入含有水凝膠的紙張，將紙張堆疊呈腫瘤組織樣3D結(jié)構(gòu)，共6層（L1～L6），氧氣和營養(yǎng)逐層降低，和體內(nèi)情況類似。給予8 Gy輻射處理，層輻射區(qū)域與未輻射區(qū)域的細(xì)胞代謝活性存在較大差異。L1和L2的代謝活性下降了35%～59%；L3降低了17%～52%；L4和L5也下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；L6未檢測(cè)出。此外，L1到L6缺氧標(biāo)志物缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α 和 碳 酸 酐 酶 9（carbonic anhydraseⅨ，CAⅨ）表達(dá)增加；對(duì)應(yīng)的L1細(xì)胞增殖最高，L6最低。結(jié)果表明細(xì)胞增殖會(huì)隨著氧氣濃度減少而下降，使得細(xì)胞對(duì)放療的敏感性也在逐層下降[25]。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)用于肺癌的相關(guān)研究太少，還需要大量數(shù)據(jù)才能說明其在放療中的優(yōu)勢(shì)。

4 三維培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建可用于長期研究的肺癌細(xì)胞系

Zhang等[21]利用來源于肺癌患者腫瘤組織中的原代細(xì)胞，在補(bǔ)充有1%FBS，10%N-2，200 ng/ml Noggin的Advanced DMEM/F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)了120 d后，HE染色顯示與原始腫瘤組織無差異。將其在液氮中冷凍一段時(shí)間，解凍后細(xì)胞活力仍保持在90%以上。LIU等[14]證實(shí)了FGF1和IGF1可以顯著促進(jìn)A549-3D中肺癌干細(xì)胞的增殖，同時(shí)抑制其凋亡。并利用此特性，在RPMI-1640完全培養(yǎng)基中加入20 ng/ml FGF1和50 ng/ml IGF1培養(yǎng)A549細(xì)胞的肺癌干細(xì)胞，在長期研究中可作為一種潛在的細(xì)胞系。與二維培養(yǎng)相比，三維培養(yǎng)可以達(dá)到4周以上[7]。建立用于長期研究的細(xì)胞系有利于對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移及耐藥形成過程進(jìn)行長期與連續(xù)的觀察，深入了解相關(guān)機(jī)制。

5 總結(jié)

與二維培養(yǎng)相比，三維培養(yǎng)在腫瘤細(xì)胞的生存能力、形態(tài)、增殖、遷移、基因蛋白表達(dá)以及細(xì)胞間相互作用等方面具有優(yōu)勢(shì)。利用三維培養(yǎng)技術(shù)在體外培養(yǎng)腫瘤球體，可以模擬體內(nèi)腫瘤形成脈管系統(tǒng)、低氧區(qū)域、藥物吸收差異以及較低的增殖率，同時(shí)，三維培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞具有更好的穩(wěn)定性，可培養(yǎng)4周以上甚至更長的時(shí)間，能夠用于腫瘤的長期研究和動(dòng)態(tài)研究。此外，還可以加入腫瘤微環(huán)境中的物質(zhì)或細(xì)胞進(jìn)行三維共培養(yǎng)，研究細(xì)胞-基質(zhì)、細(xì)胞-細(xì)胞之間的作用機(jī)制，這是二維培養(yǎng)技術(shù)所不具備的[6-7，26]。在三維培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中，蛋白質(zhì)的表達(dá)隨著培養(yǎng)時(shí)間而發(fā)生變化，這可能與腫瘤微環(huán)境改變或藥物作用等因素引起腫瘤細(xì)胞相關(guān)基因改變所導(dǎo)致的[10，27]。最后，三維細(xì)胞培養(yǎng)具有高保真性。三維培養(yǎng)的細(xì)胞幾乎整個(gè)表面都暴露于微環(huán)境或其他細(xì)胞，而二維培養(yǎng)的細(xì)胞只有接近一半的表面暴露于液體，一半暴露于培養(yǎng)基表面或中間，只有小部分表面與其他細(xì)胞接觸。三維細(xì)胞培養(yǎng)存在氧氣、營養(yǎng)和代謝產(chǎn)物，可以引起不同層級(jí)細(xì)胞的增殖和分化差異，并導(dǎo)致不同層級(jí)細(xì)胞對(duì)藥物的敏感度不同。因此，三維細(xì)胞培養(yǎng)能更好地模擬體內(nèi)的TME及細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用[7，28]。

三維培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用還有一些局限性：①培養(yǎng)初期，細(xì)胞增殖速率低，不及二維培養(yǎng)，可能需要更長的培養(yǎng)周期；②基于支架的三維模型構(gòu)建需要較高的成本，但應(yīng)用懸滴技術(shù)或生物容器等制備也不需要較高的成本；③不同批次的三維支架具有較低的重復(fù)性[7]。利用三維細(xì)胞培養(yǎng)模擬體內(nèi)腫瘤生長的特點(diǎn)，可以改善藥物的臨床轉(zhuǎn)化率，對(duì)于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥機(jī)制等研究具有優(yōu)勢(shì)，是目前細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)。

6 展望

運(yùn)用三維培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建的3D細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞-細(xì)胞與細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，形成氧氣、營養(yǎng)、代謝產(chǎn)物以及藥物濃度梯度，能夠模擬腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的增殖、分化、轉(zhuǎn)移、血管形成以及腫瘤微環(huán)境等多個(gè)過程，在腫瘤藥物篩選和耐藥機(jī)制研究中顯示出巨大潛力?？傮w上，三維培養(yǎng)技術(shù)在肺癌中的應(yīng)用并不成熟。查閱相關(guān)數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，三維培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于肺癌細(xì)胞的研究較少，相關(guān)研究基本上處于探索階段。后續(xù)還需要更多的基礎(chǔ)研究為其搭建理論基礎(chǔ)，下一步建立相關(guān)臨床研究，證實(shí)其在藥物篩選、耐藥機(jī)制等方面的應(yīng)用價(jià)值。