曾琳琳，付學奇

(吉林大學生命科學學院 Edmond Fischer細胞信號傳導實驗室，吉林 長春130012)

1 細胞凋亡在阿爾茨海默病(AD)中的作用

AD是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病理特征為β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積，Tau蛋白高度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)，以及大量神經(jīng)元死亡導致大腦功能調(diào)控紊亂，從而出現(xiàn)嚴重的記憶認知障礙[1]。由于AD的具體發(fā)病機制尚不明確，目前臨床上并沒有成熟有效的治療手段或者藥物。

近年來，阻斷神經(jīng)元大量凋亡已經(jīng)成為緩解AD的重要方向和手段。Aβ蛋白沉積可引起氧化應(yīng)激、Ca2+通道受損，進而破壞線粒體，激活線粒體內(nèi)源性細胞信號傳導通路，誘導神經(jīng)細胞凋亡。Aβ還能夠調(diào)控凋亡相關(guān)基因Bcl-2家族蛋白表達，其中促凋亡基因Bim表達升高，抗凋亡基因Bcl-xl表達降低。

AD分為家族性AD(fAD)或散發(fā)性AD(sAD)，fAD主要表現(xiàn)為3種基因的突變：Aβ前體蛋白(APP)、早老素1(PS1)和早老素2(PS2)，每種基因都編碼各自的蛋白質(zhì)[2]。其中APP可以與死亡受體6(DR6)相互作用，并通過激活DR6，調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移分子機制[3-5]。PS1與PS2均與細胞凋亡密切相關(guān)，PS1可以通過γ-分泌酶活性及與Presenilin1相關(guān)蛋白PSAP(Presenlin1-associated protein)相互作用兩條途徑誘導細胞凋亡的發(fā)生，而線粒體特異性蛋白PSAP在DR6誘導的細胞凋亡中扮演著重要的角色[6]。由此可見，細胞凋亡在AD發(fā)病機制中發(fā)揮著重要的作用，阻斷神經(jīng)元大量凋亡是未來預防及治療AD的重要思路與策略之一。

2 干細胞概述

近年來，干細胞治療為神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的臨床治療帶來了希望，干細胞具有自我更新并且在腦組織中分化為神經(jīng)細胞的能力，可以通過神經(jīng)營養(yǎng)因子恢復神經(jīng)可塑性和神經(jīng)發(fā)生[7]。根據(jù)分化為不同細胞類型，干細胞可分為4種：神經(jīng)干細胞(NSCs)、間充質(zhì)干細胞(MSCs)、胚胎干細胞(ESCs)和誘導多能干細胞(iPSCs)[8]。這些干細胞都具有不同的特征，可以以不同方式在不同疾病中參與治療。間充質(zhì)干細胞因其易于分離及體外培養(yǎng)，而且免疫原性低，不涉及倫理問題，是近年來研究較多的干細胞之一。

MSCs來源廣泛，可存在骨髓、脂肪組織、肺、肝和臍帶等多種組織[9]，并具有分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞和胰島等潛能[10]。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMMSCs)能夠參與免疫系統(tǒng)紊亂和由免疫因子介導的神經(jīng)退行性疾病，包括IL-1、IL-6、IL-17和腫瘤壞死因子-inhibitor[11-14]。MSCs通過Wnt通路體外介導增加海馬區(qū)神經(jīng)再生和分化[15]，而將人臍血間充質(zhì)干細胞移植到AD小鼠模型的側(cè)腦室或海馬區(qū)內(nèi)，可阻斷Aβ42的沉積及神經(jīng)元的變性退化，從而改善記憶認知能力[16-17]。不僅如此，大鼠脂肪源性干細胞(ADSCs)也發(fā)現(xiàn)能夠誘導分化為神經(jīng)元細胞，改善AD動物模型認知障礙，提高學習記憶能力[18]。盡管MSCs治療是一種很有前途的治療手段，但在應(yīng)用中都存在著各種各樣的缺陷。比如骨髓來源的間充質(zhì)干細胞，提取和培養(yǎng)困難，限制了其在臨床試驗中的應(yīng)用。很多MSCs也存在排斥反應(yīng)、靶向性和歸巢性差等局限性。然而，研究報道MSCs也可分泌多種生物因子，比如神經(jīng)營養(yǎng)因子、血管生成因子等促進神經(jīng)再生，保護軸突退化變性，誘導血管生成等，從而在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中發(fā)揮作用。

3 外泌體(exosomes)的生物學作用

大量研究指出細胞外囊泡(EVs)在細胞生物學功能與疾病發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用，其中，外泌體是細胞在不同生理條件下釋放到細胞外基質(zhì)的一類直徑約40-200 nm的微小囊泡。外泌體在細胞發(fā)育、免疫應(yīng)答、腫瘤發(fā)生等生物學過程中研究比較廣泛[19-20]。

MSC-EVs能夠參與抑制腫瘤的增殖、遷移和侵襲。據(jù)報道，MSC-EVs將miR-133b轉(zhuǎn)移至膠質(zhì)瘤細胞中，通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路來潛在抑制EZH2的表達，從而抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖和遷移[21]。hU-MSCs-EVs通過降低Bim、Bad、Bax蛋白水平，抑制caspase-3和caspase-9活化，有效提高大鼠腎小管上皮細胞NRK細胞存活率，從而抑制細胞凋亡，控制順鉑腎毒性，提高順鉑的臨床治療效果[22]。

從角膜基質(zhì)干細胞(CSSC)中提取的間充質(zhì)干細胞能預防小鼠角膜損傷后纖維化瘢痕形成，促進透明基質(zhì)組織再生。來自CSSC的EVs與活細胞同樣有效地減少了小鼠角膜傷口的視覺疤痕，說明了細胞外囊泡在CSSC細胞阻斷瘢痕形成和啟動角膜透明組織再生過程中有重要作用[23]。

MSCs分泌的外泌體對于許多疾病有治療前景，將周細胞的外泌體移植至脊髓損傷小鼠可恢復其運動功能，因為周細胞的外泌體可以減少病變，改善運動功能，改善血液循環(huán)，修復脊髓損傷產(chǎn)生的缺陷。此外，外泌體還可以改善內(nèi)皮細胞的功能，調(diào)節(jié)血流，減輕水腫，HIF-1a、Bax、Aquaporin-4和MMP2表達下降而Claudin-5、Bcl-2表達上升，抑制細胞凋亡。同時還與PTEN/AKT通路密切相關(guān)，提示周細胞外泌體對脊髓損傷有治療前景[24]。

4 外泌體在AD中的作用

AD是最常見的神經(jīng)退行性疾病，可導致學習和記憶障礙。來源于MSCs的細胞外囊泡可以作為一種替代性的治療手段。MSC-EV不僅具有傳遞脂類/蛋白質(zhì)/酶/microRNAs的能力，而且能夠抗炎、促進Aβ降解和維持神經(jīng)活性，因此可以修復突觸功能，阻斷神經(jīng)元的死亡，并減緩AD患者的記憶障礙[25]。AD的病理特征源于腦內(nèi)Aβ的不平衡穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，從AD患者腦脊液和血漿、AD小鼠模型的血漿樣品以及表達PS1突變體的神經(jīng)細胞培養(yǎng)基中分離出的EVs，能破壞神經(jīng)元的Ca2+穩(wěn)態(tài)，損害線粒體功能，并使神經(jīng)元對細胞毒性更加敏感。EVs中Aβ含量相對不高，但Aβ42/Aβ40比值有所增加；Aβ大部分位于EVs表面。溶酶體功能受損導致EVs的生成增加，Aβ42表達水平升高。EVs可介導致病性Aβ的跨細胞傳播，損害神經(jīng)元的Ca2+代謝和線粒體功能，從而使神經(jīng)元易受細胞毒性的影響[26]。

雖然體外實驗證明，由AD神經(jīng)元生成的EVs具有神經(jīng)毒性，但對AD-EVs在體內(nèi)的作用機制知之甚少。微管相關(guān)蛋白tau的高度磷酸化在fAD相關(guān)神經(jīng)變性中也發(fā)揮關(guān)鍵作用，表明Tau蛋白可通過EVs的傳遞在AD大腦中產(chǎn)生影響。文獻報道[27]一名攜帶PS1A246E突變的fAD患者來源的iPSC-神經(jīng)元培養(yǎng)基分離出EVs，注射至野生型C57BL/6小鼠的海馬區(qū)中，5周后，對小鼠實施安樂死并進行病理學評估，與對照組相比，注射fAD-EVs的小鼠在多個部位顯示tau蛋白磷酸化增加。此外，fAD-EV注射的海馬CA1區(qū)tau內(nèi)含物明顯多于對照組。這些研究結(jié)果均表明，EVs能夠介導fAD相關(guān)的tau功能改變，為將來研究EV靶向治療fAD的臨床治療和藥物開發(fā)提供了理論依據(jù)和科學基礎(chǔ)。

Bieberich課題組的實驗結(jié)果不僅說明外泌體與AD中Aβ的聚集和tau蛋白傳播擴散有關(guān)，而且，在進一步的實驗中，中性鞘磷脂酶-2(nSMase2)在神經(jīng)細胞中的抑制或沉默可以阻斷外泌體的形成。有研究構(gòu)建了nSMase2基因缺失的AD小鼠，通過體外和體內(nèi)實驗檢測Aβ42的生成及聚集，體外實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制了Aβ42對膠質(zhì)細胞清除的能力，并證明了富含神經(jīng)酰胺的外泌體能夠參與斑塊的形成。與普通AD小鼠相比，nSMase2基因缺失的AD小鼠在恐懼條件下的學習任務(wù)中降低了腦外泌體生成、神經(jīng)酰胺水平及血清抗氧化IgG含量，調(diào)節(jié)膠質(zhì)細胞激活、Aβ42聚集、tau磷酸化水平，改善了認知能力[28]。

Micci等人研究了海馬神經(jīng)干細胞分泌的外泌體促進突觸對Aβ寡聚體(Aβo)彈性的影響，實驗從海馬神經(jīng)干細胞(NSC-exo)或成熟海馬神經(jīng)元(MN-exo)培養(yǎng)基中分離的外泌體，在評估Aβο誘導的海馬長時程增強(LTP)和記憶缺陷的抑制前，將其注射入側(cè)腦室(ICV)，結(jié)果表明，NSC-exo而不是MN-exo，可以消除Aβo誘導的LTP抑制的記憶缺陷，還顯著降低Aβo與突觸的結(jié)合。同時，內(nèi)源性NSC-exo的轉(zhuǎn)基因切除增加了突觸與Aβo結(jié)合，而外源性NSC-exo抑制了這種結(jié)合。這些結(jié)果揭示了一種新的機制，將NSC-exo和突觸對Aβo的易感性聯(lián)系起來[29]。

減少Aβ的積聚是治療AD的一種主要方法，在AD治療中，來自不同尺寸支架細胞的外泌體是否能減少Aβ沉積或改善認知功能下降至關(guān)重要。文獻報道以三維石墨烯支架和二維石墨烯薄膜為基質(zhì)，進行人臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)，從中提取上清液分離外泌體。3D培養(yǎng)的外泌體(3D-Exo)中195種miRNA和蛋白質(zhì)(包括neprilysin、胰島素降解酶和熱休克蛋白70)的水平與2D培養(yǎng)的差異顯著。因此，3D-Exo可以通過其特殊的載體上調(diào)AD病理細胞和轉(zhuǎn)基因小鼠α-分泌酶的表達，下調(diào)β-分泌酶，從而降低Aβ的產(chǎn)生，對改善AD小鼠的記憶和認知功能障礙具有增強的治療作用。這些發(fā)現(xiàn)為干細胞來源的支架材料和功能性外泌體提供了新的臨床應(yīng)用[30]。

ADSC在治療AD等神經(jīng)退行性疾病方面也具有潛在的治療前景，許多研究表明，Aβ通過神經(jīng)元細胞的線粒體功能障礙在AD的進展中起著關(guān)鍵作用。以TG2576 AD小鼠腦NSCs為材料，研究ADSC外泌體(ADSC-Exo)對AD表型的影響。結(jié)果顯示，ADSC-Exo處理可降低AD細胞的Aβ42、Aβ40水平和Aβ42/40比值。ADSC-Exo處理使p53、Bax、裂解的caspase-3增加，Bcl-2蛋白水平降低，從而抑制AD神經(jīng)元細胞凋亡。此外，AD患者大腦中被Aβ?lián)p傷的軸突生長通過ADSC-Exo治療得到增強。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)提示ADSC-Exo在轉(zhuǎn)基因小鼠AD體外模型中具有調(diào)節(jié)疾病的作用，ADSC-Exo可以作為改善Aβ誘導的神經(jīng)元死亡和AD進展的治療源[31]。

5 展望與總結(jié)

包括MSCs在內(nèi)的干細胞對于神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的臨床應(yīng)用目前已經(jīng)得到廣泛的認可，但是干細胞治療依然存在很多問題和風險。近年來，MSCs可通過分泌外泌體參與血管生成、神經(jīng)元胞體退化，神經(jīng)軸突變性，神經(jīng)保護等過程，從而治療神經(jīng)退行性疾病。與MSCs相比，外泌體優(yōu)勢明顯，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、體積小，生物相容性較好，可以通過血腦屏障，是治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的理想藥物載體。但是，外泌體成分復雜，MSCs-EV可分泌多種因子，包括神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子、成纖維細胞生長因子等，不同細胞來源的外泌體的內(nèi)容物不盡相同，生物學功能也存在差異。總而言之，外泌體廣泛應(yīng)用于臨床治療，或者作為載體用于藥物開發(fā)，尤其針對于神經(jīng)系統(tǒng)疾病，仍然處于起步階段。還需要對外泌體相關(guān)分子機制進行深入的研究，明確不同來源外泌體的內(nèi)含物、分泌物以及與細胞間的信號傳導，不同條件下對外泌體的調(diào)控以及其與靶蛋白的相互作用。隨著神經(jīng)退行性疾病的研究不斷深入，外泌體在臨床應(yīng)用中的重要作用也會逐漸顯現(xiàn)，在臨床應(yīng)用及藥物開發(fā)中具有廣泛前景。