范哲源，孫嘉陽，張云峰，胡高戩，劉澤平，王星星，呂佳音

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨關(guān)節(jié)與運動醫(yī)學(xué)，吉林 長春130033)

運動系統(tǒng)功能的實現(xiàn)需要借助多種組織的協(xié)調(diào)活動，包括一些結(jié)締組織，如連接骨與肌肉的肌腱和連接骨與骨之間的韌帶[1-4]。復(fù)雜的結(jié)構(gòu)決定了肌腱與韌帶在人體進行活動時其受傷的概率大大增加。大部分前交叉韌帶損傷集中在患者運動中的非接觸性損傷，尤其是滑雪運動中[5-6]。目前關(guān)節(jié)鏡下的前交叉韌帶重建手術(shù)已被大多數(shù)臨床醫(yī)生視為該結(jié)構(gòu)損傷的首選治療方法[7]，在臨床中取得了非常理想的療效。但是腱骨愈合的不成熟導(dǎo)致腱骨界面仍是重建后復(fù)合體中最薄弱的部分[8]。這導(dǎo)致了骨隧道擴大、膝關(guān)節(jié)松弛、重建韌帶失效等術(shù)后相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生。類似的情況還包括肩袖、后交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶等部位的損傷。研究者們發(fā)現(xiàn)多種生長因子(如轉(zhuǎn)化生長因子-β、血管內(nèi)皮生長因子、骨形態(tài)生成蛋白、成纖維細胞生長因子、粒細胞集落刺激因子等)、各種來源的間充質(zhì)干細胞(如骨髓、脂肪、肌腱等)、各類可降解支架、體外低強度脈沖超聲波等均可以對腱骨愈合產(chǎn)生積極的影響。機械刺激也是影響腱骨愈合的重要因素之一，但是具體的影響以及發(fā)生機制仍處于爭議中。機械刺激在實際的臨床工作中可以以康復(fù)鍛煉的形式表現(xiàn)，盡快開始進行康復(fù)鍛煉可以幫助患者提前恢復(fù)肌肉力量和本體感覺，并降低遠期關(guān)節(jié)僵硬的發(fā)生。但是過早的康復(fù)鍛煉又會使初期較為脆弱的腱骨界面發(fā)生微動，進而產(chǎn)生未知的生物學(xué)與組織學(xué)變化。本文對近些年有關(guān)機械刺激與腱骨愈合的相關(guān)文獻進行綜述，以期對臨床治療提供依據(jù)。

1 腱骨愈合的發(fā)生

1.1 天然腱骨結(jié)構(gòu)

肌腱與骨骼之間的連接位點是一種復(fù)雜過渡區(qū)域。在以直接插入作為插入方式的組織，如前交叉韌帶中，天然的腱骨過渡區(qū)是由肌腱、未鈣化的纖維軟骨、鈣化的纖維軟骨、骨骼的4個區(qū)域構(gòu)成的[9]。在組織學(xué)的研究中可以發(fā)現(xiàn)這一變化是逐漸發(fā)生的，這一結(jié)構(gòu)的剛性會隨著膠原纖維的排列與逐漸發(fā)生的鈣化而增加[10]。而非直接插入的組織，如內(nèi)側(cè)副韌帶中，插入位點則由Sharpey纖維構(gòu)成。這種纖維與肌腱與骨的長軸斜向固定以在兩種組織之間起到錨定[10]。對于韌帶損傷的手術(shù)處理目前大部分選擇將肌腱與骨直接接觸，早期利用瘢痕愈合提供腱骨界面的初始強度，遠期依靠腱骨愈合以達到或接近健側(cè)肢體的組織強度。

1.2 腱骨愈合過程

腱骨愈合的過程目前尚未完全明確。過程可能涉及括隧道內(nèi)成骨、新生骨塑形、腱骨界面形成血供、Sharpey 纖維的形成及纖維軟骨鈣化等多個環(huán)節(jié)共同調(diào)節(jié)。最早的愈合階段主要為炎癥反應(yīng)，主要由特定的巨噬細胞的亞群介導(dǎo)。手術(shù)后4天，從循環(huán)和中性粒細胞中募集的巨噬細胞出現(xiàn)在腱骨界面中，并且參與吞噬細胞碎片，募集額外的炎癥細胞，并協(xié)助促進促炎細胞因子釋放。在10天后，原本和后產(chǎn)生的巨噬細胞可以被區(qū)分出來。這些炎性細胞將產(chǎn)生多種細胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)，這有助于形成骨隧道與移植物之間的纖維血管瘢痕組織界面。在術(shù)后前8周，肌腱骨界面發(fā)生免疫組織學(xué)變化，此時表面出現(xiàn)巨噬細胞與骨髓衍生的干細胞的浸潤。最初，該界面主要含有Ⅲ型膠原蛋白，并產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和成纖維細胞生長因子(FGF)等生長因子，刺激抗血管生成和成纖維細胞的生成。同時骨隧道開始了隧道壁的細胞骨化和軟骨細胞生成，這一過程中減少了肉芽組織并產(chǎn)生了Ⅱ型膠原蛋白。肉芽組織逐漸被骨組織和軟骨細胞替代。同時，隧道和移植物之間的剪切應(yīng)力導(dǎo)致產(chǎn)生更多的夏普氏纖維，并從移植物的邊緣表達FGF，吸引成纖維細胞進入移植物中并產(chǎn)生Ⅲ型膠原蛋白。在增殖階段期間干細胞發(fā)生增殖和分化，新生骨骼慢慢成形，復(fù)合物強度也隨之改善。隨著肌腱移植物和骨骼之間膠原纖維的連續(xù)性、細胞性和血管性的降低，腱骨界面逐漸完成移植物的重塑。

2 不同手術(shù)模型對于腱骨愈合的不同響應(yīng)

2.1 非骨隧道內(nèi)模型

Hettrich等人構(gòu)建了將小鼠髕腱離斷后重新將其附著在天然足印區(qū)的動物模型[11]。術(shù)后對腱骨復(fù)合物施加機械負(fù)載，以施加負(fù)載的開始時機和負(fù)載強度作為因變量，分為固定組，立即負(fù)荷組，低負(fù)荷延遲4天組，低負(fù)荷延遲10天組，高負(fù)荷延遲4天組，高負(fù)荷延遲10天組。之后選擇多個時間點將小鼠處死，進行組織學(xué)、免疫組化、影像學(xué)和生物力學(xué)等相關(guān)分析。最終結(jié)果提示術(shù)后固定可以形成機械強度更強，組織排列更好的腱骨界面，固定組在4、10、21天時具有更好的膠原纖維組織；在10、21、28天時有著更低的MMP-13的表達；所有時間點都較少的凋亡細胞；4和28天時更少的IL-1B。這些結(jié)果表明固定處理可以形成強度更高的腱骨復(fù)合物，改善了腱骨界面的結(jié)構(gòu)和組成。Zhang等人研究顯示出與上述相似的結(jié)果[12]。在使用單側(cè)岡上肌肌腱離斷后再修復(fù)的模型中，該實驗分為術(shù)后立即隨意活動組和7天后跑步機活動組。結(jié)果顯示跑步機組在4周時在新生骨量與腱骨復(fù)合物強度的表現(xiàn)上均優(yōu)于對照組，8周時2組之間的差異較小。隨后研究者又進行了定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和免疫熒光染色實驗，提示在肩袖損傷后修復(fù)的模型中，機械刺激可能通過增加降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、P物質(zhì)(SP)和外周神經(jīng)肽Y(NPY)等的表達來促進腱骨愈合。Wada等人選擇類似的小鼠岡上肌模型比較術(shù)后固定與術(shù)后負(fù)荷組，結(jié)果提示過度負(fù)荷可能由于影響了Ihh和 Wnt/β-Catenin通路的活化，導(dǎo)致腱骨界面強度下降[13]。以上的研究提示在肌腱直接附著在骨骼上的手術(shù)模型中早期較長時間的固定對于提高復(fù)合體的失效負(fù)荷，新生骨的體積等方面有積極意義。

2.2 骨隧道內(nèi)手術(shù)模型

移植物在骨隧道內(nèi)的愈合可能與其受力的方式有關(guān)。有人將雌性日本白兔的趾長伸肌腱的近端游離，然后將肌腱與脛骨長軸垂直方向穿過骨隧道，將動物于6、8、12、24周時處死再進行組織學(xué)分析。結(jié)果顯示拉伸力可以增強腱骨界面的再生，壓力可以促進纖維軟骨的形成，而剪切力對于腱骨愈合似乎沒有影響[14]。與之采用類似的方法對移植肌腱進行固定的另一組實驗在實施過程中加入了間充質(zhì)干細胞或新鮮骨髓，實驗結(jié)果表明加入了新鮮骨髓的組別出現(xiàn)了生物力學(xué)強度更高，更多新鮮骨形成的腱骨界面[15]。這似乎與更多的M2巨噬細胞和更少的M1巨噬細胞表達有關(guān)。Rodeo等人則使用了忽略剪切力和壓力，以拉伸力為主要研究的出發(fā)點，將小鼠分為固定組，低應(yīng)力組與高應(yīng)力組[16]，結(jié)果顯示低應(yīng)力組在3周時顯示出更高的失效負(fù)載，但是這種生物力學(xué)上的優(yōu)勢在6周時不復(fù)存在，而固定組在3、6周時都表現(xiàn)出更高的骨體積分?jǐn)?shù)。

前交叉韌帶重建是最常應(yīng)用的骨隧道手術(shù)模型[17-19]，所以更多的研究者選擇了以前交叉韌帶重建為模型的動物實驗，以期尋找術(shù)后機械負(fù)載對于腱骨愈合的影響[20-22]。為了尋找不同等級的機械負(fù)載對腱骨愈合的影響，Ma等人對小鼠的前交叉韌帶重建模型的股骨隧道進行調(diào)節(jié)，進而改變隧道內(nèi)移植物的受力[22]。最終的結(jié)果顯示固定化對于腱骨復(fù)合物的骨形成有積極的影響，而較低應(yīng)力的刺激對于遠期提升腱骨復(fù)合物強度有幫助，高應(yīng)力刺激可能由于更多的破骨細胞表達從而延遲腱骨愈合。有研究者從康復(fù)的角度用兔子模型模擬人在前交叉韌帶重建術(shù)后進行CPM鍛煉。結(jié)果顯示經(jīng)歷兩周CPM訓(xùn)練的組別有著更多的纖維軟骨生成，更多的膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ、堿性磷酸酶、肌腱蛋白C等前體物質(zhì)的表達，從而提升了腱骨復(fù)合物的強度，體外培養(yǎng)的結(jié)果與動物實驗的結(jié)果相似，佐證了機械刺激對骨髓間充質(zhì)干細胞與肌腱細胞的影響。當(dāng)以術(shù)后開始進行機械負(fù)荷的時間作為變量時，一定的固定時間之后再進行活動在腱骨愈合過程中更具優(yōu)勢[20]。這種固定時間似乎與隧道外模型有所不同，較短時間的固定輔以低應(yīng)力的刺激可以在遠期展現(xiàn)出更加穩(wěn)定的腱骨界面，但是暫時無法將最佳的負(fù)荷時間同步應(yīng)用到人類的康復(fù)過程中。

2.3 兩種類型模型產(chǎn)生差異的可能原因

不同的模型產(chǎn)生了不同的愈合效果，在移植物以附著的方式與骨骼相接觸的模型中，無機械刺激的腱骨界面有著更具優(yōu)勢的愈合，而當(dāng)移植物在骨隧道中時，早期較低強度的刺激和較短的固定時間均可以提高腱骨復(fù)合物的生物力學(xué)強度與組織連續(xù)性。

機械刺激可以促進TGF-β的表達，這一細胞因子的兩個亞型(TGF-β1，TGF-β3)均與腱骨愈合有密切聯(lián)系[23-26]。TGF-β3可以促進細胞外基質(zhì)的形成，顯著增強腱骨界面的結(jié)構(gòu)和機械性能，在胎兒和新生兒環(huán)境中促進皮膚傷口和肌腱愈合并不形成疤痕。同時TGF-β3對于愈合過程的加速效應(yīng)也是明顯和全程的。遺憾的是，TGF-β3未在成人的肌腱愈合中發(fā)現(xiàn)。而另一亞型TGF-β1同樣影響著腱骨愈合。Wang等人對于TGF-β與腱骨愈合之間的關(guān)系有著更加深入的研究。在對新西蘭白兔行前交叉韌帶重建術(shù)后6周，TGF-β過表達組形成了更加明確的軟骨區(qū)域，而即使在12周后抑制組中肌腱與骨骼仍未形成有效的連接。三維CT的結(jié)果也提示TGF-β過表達組可能促進更多的新骨形成從而降低術(shù)后骨隧道擴大的發(fā)生[27]。另一方面，機械刺激對于骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)同樣具有加強增殖、分化同時抑制凋亡的調(diào)節(jié)[28]。TGF-β同時又可以對骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)產(chǎn)生募集作用，兩者均受機械刺激的正向調(diào)控，并都對腱骨愈合產(chǎn)生促進作用。但是這種愈合優(yōu)勢在早期可能會被過多的瘢痕組織所影響進而降低遠期復(fù)合物之間的愈合。在穿過骨隧道的模型中由于受到更多骨髓組織的影響，機械刺激對于BMSC的促進作用會被放大，這與僅僅附著在骨表面的模型是截然不同的。猜測可能造成了以類似肩袖損傷后修復(fù)為原型的動物模型中機械刺激對于腱骨愈合的負(fù)面結(jié)果。深層次的原因需要更多的實驗研究去證實。