張紅偉，王 帥，張春媚，趙忠?guī)r

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，吉林 長(zhǎng)春130033)

ARDS(急性呼吸窘迫綜合征)是以肺順應(yīng)性降低、呼吸衰竭、頑固性低氧血癥為特點(diǎn)的一類異質(zhì)性疾病的統(tǒng)稱，在重癥監(jiān)護(hù)室總發(fā)病率占10%，病死率高達(dá)35%-40%，彌漫性肺泡損傷是其病理特征性改變，表現(xiàn)為肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞破壞，Ⅱ型上皮細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞壞死，而后進(jìn)展為肺泡結(jié)構(gòu)功能改變，不可逆性肺纖維化。在炎癥反應(yīng)中，近些年研究發(fā)現(xiàn)致病微生物和免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡在引發(fā)和調(diào)節(jié)ARDS病理反應(yīng)中具有重要作用。

1 細(xì)胞外囊泡分類和功能

細(xì)胞外囊泡樣分子最初是由Chargaff和West于1946年首次介紹出來，EVs在正常血漿中被認(rèn)為是促凝血功能的血小板衍生顆粒[1]，1983年P(guān)hilip Stahl和Clifford Harding通過脈沖追逐(pulse-chase)和電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)多泡體與細(xì)胞膜融合釋放出小的膜泡,而后Johnston將這種囊泡定義為外泌體[2]。隨后的眾多研究者發(fā)現(xiàn)所有細(xì)胞都可以釋放EVs，由于研究方法、實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)、生物標(biāo)本來源等不統(tǒng)一，研究者在對(duì)各囊泡的命名上也不一致，例如文中提到的微粒(microparticle)后來認(rèn)為是屬于微泡范疇，ISEV先后在2014年和2018年發(fā)表關(guān)于EVs的最低標(biāo)準(zhǔn)要求，將該類囊泡樣物質(zhì)用EVs概念進(jìn)行統(tǒng)稱。EVs大致可分為3類：外泌體(exosomes)40-200 nm、微泡(microvesicles)200-2 000 nm和凋亡小體(apoptotic bodies)500-2 000 nm；外泌體是內(nèi)吞體向內(nèi)凹陷形成多泡體(MVB)，后多泡體與細(xì)胞膜融合釋放出外泌體；微泡起源于細(xì)胞膜，是通過細(xì)胞膜向外出芽生成；凋亡小體是在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)生細(xì)胞膜破裂時(shí)釋放。已證實(shí)的ESCRT(內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體)系統(tǒng)在多泡體的形成以及釋放外泌體中起著重要作用[3]。EVs與其母細(xì)胞具有相同表面標(biāo)記蛋白，比如肺泡上皮細(xì)胞所衍生出的EVs具有表面活性蛋白(caveolin-1)，外泌體中富含上皮黏蛋白，黑色素瘤細(xì)胞微泡富含囊泡相關(guān)膜蛋白3(VAMP3)，外泌體富含轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，但這種轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在微泡中幾乎不存在[4]。但是目前來說不存在能識(shí)別EVs的唯一特定標(biāo)記物，CD9、CD63、CD81和CD82等均可在外泌體和微泡中表達(dá)。

不同于細(xì)胞間直接接觸與細(xì)胞分泌的信號(hào)分子傳遞信息，EVs是細(xì)胞間通訊的第3種方式，是作為功能性細(xì)胞膜和胞質(zhì)蛋白、脂質(zhì)和核酸的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移載體，它們可以通過囊泡表面膜蛋白與受體膜蛋白直接作用或者和受體細(xì)胞粘附融合后釋放內(nèi)部包裹的核酸、蛋白質(zhì)或脂類物質(zhì)等調(diào)控受體細(xì)胞的細(xì)胞功能[5]。在ARDS動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)EVs在肺內(nèi)免疫應(yīng)答和炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中處于重要地位[6]。EVs中的RNA主要包含了tRNA、rRNA、mRNA、miRNA、長(zhǎng)鏈RNA等，這些均含有大量的3′UTR mRNA片段，并且有多個(gè)microRNA(miRNA)結(jié)合位點(diǎn)，提示EVs作為miRNA循環(huán)的載體調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，這也是miRNA的研究在EVs中成為重點(diǎn)的原因[7]；相比對(duì)于RNA的大量研究，DNA成分在EVs中研究較少，最近有研究者對(duì)EVs中的dsDNA和組蛋白存在提出質(zhì)疑[8]；EVs中的脂類物質(zhì)主要包含磷脂酰絲氨酸、膽固醇、脂肪酸、神經(jīng)鞘磷脂、神經(jīng)酰胺等，是組成囊泡雙層脂質(zhì)膜的成分，不同類型的EVs其脂質(zhì)結(jié)構(gòu)也不相同。EVs中的蛋白質(zhì)成分包括了表面抗原(MHCI、MHCII)、粘附因子(比如整合素、乳凝集素、ICAM)、多種趨化因子和炎性細(xì)胞因子等(如IL-1β、IL-1α、IL-6、IL-8、IL-18、IL-32、TNF、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5和CCL20)，這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)中有著重要作用。除此之外，針對(duì)EVs對(duì)蛋白質(zhì)和基因在細(xì)胞外環(huán)境中可以起到保護(hù)作用的特點(diǎn)，有研究認(rèn)為可將其作為一種潛在生物標(biāo)記物的來源，以及作為靶向藥或基因的載體，在治療上可能具有廣闊前景[4]。

2 病原微生物分泌的EVs在ARDS中的作用

微生物感染和ARDS密切相關(guān)，細(xì)菌EVs是在上世紀(jì)60年代的關(guān)于大腸桿菌的報(bào)道中首次提出的，1990年以后至今對(duì)細(xì)菌EVs的研究不斷增加，主要以研究革蘭陰性菌占多數(shù)，其產(chǎn)生EVs的途徑主要是通過擠壓的方式(pinching off)出膜，因?yàn)橄啾容^革蘭陰性菌，革蘭陽(yáng)性菌的細(xì)胞膜外有一層厚的肽聚糖細(xì)胞壁，囊泡如何出膜機(jī)制尚不清楚(真菌和分枝桿菌同樣也不清楚)，通常將革蘭陰性菌的EVs稱OMVs(Outer Membrane Vesicles)，可以攜帶毒力因子、DNA、RNA、免疫調(diào)節(jié)因子等。細(xì)菌EVs與宿主細(xì)胞作用有以下3種途徑：直接激活宿主受體、傳遞細(xì)菌EVs內(nèi)容物和完全融入宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。OMVs通過病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)誘導(dǎo)炎癥免疫應(yīng)答，PAMPs中的LPS、肽聚糖、鞭毛蛋白、孔蛋白以及脂蛋白與宿主細(xì)胞的TLR作用后，通過MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)炎性因子分泌[9]。最近的研究也證實(shí)了細(xì)菌的EVs具有可以將其內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至宿主從而調(diào)節(jié)宿主先天免疫的能力。An等人發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌EVs中包含的α-溶血素是導(dǎo)致肺炎的重要毒力因子，而磷霉素可以通過降低MAPK(主要是ERK和p38途徑)磷酸化和抑制NLRP3炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)來減輕肺部感染[10]。Schlatter等人報(bào)道金黃色葡萄球菌在PSM(酚溶性調(diào)節(jié)蛋白)作用下通過增加膜流動(dòng)性促進(jìn)金葡菌膜釋放含有LPS的EVs，囊泡破裂后LPS會(huì)激活TLR2介導(dǎo)的炎癥途徑[11]。有研究者在銅綠假單胞菌的研究中證實(shí)其分泌的OMVs內(nèi)所含有的sRNA可抑制人上皮細(xì)胞炎性因子IL-8表達(dá)和減弱小鼠肺內(nèi)KC細(xì)胞因子分泌和中性粒細(xì)胞募集[12]。有研究者報(bào)道了肺炎鏈球菌EVs的免疫調(diào)節(jié)能力，EVs通過被血清蛋白識(shí)別，結(jié)合補(bǔ)體系統(tǒng)C3b啟動(dòng)補(bǔ)體替代途徑，形成補(bǔ)體復(fù)合物C5b-9，在人血清中加入肺炎鏈球菌EVs后導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的吞噬活性減弱[13]。

3 免疫細(xì)胞分泌的EVs在ARDS中的作用

ARDS的發(fā)病機(jī)制中，免疫細(xì)胞是其中必不可少的環(huán)節(jié)，參與炎癥介質(zhì)的表達(dá)和調(diào)節(jié)，肺內(nèi)固有免疫細(xì)胞包括了肺泡上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板等，他們之間可以通過各自分泌的EVs在ARDS中傳遞炎癥信號(hào)。

3.1 免疫細(xì)胞EVs參與模式識(shí)別受體(PRRs)相關(guān)信號(hào)通路

PRRs是人體固有免疫系統(tǒng)中的重要環(huán)節(jié)，是抵御病原微生物入侵的第一道防線，固有免疫細(xì)胞上的PRRs通過識(shí)別PAMP(病原相關(guān)分子模式)和DAMPs(損傷相關(guān)分子模式)等危險(xiǎn)信號(hào)來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，PRRs分4種不同類型：TLRs、CLRs(C型凝集素受體)、RLRs(甲酸誘導(dǎo)基因(RIG)-Ⅰ型受體)和NLRs[14]。關(guān)于ARDS的EVs研究主要涉及TLRs和NLRs兩種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。TLRs的特點(diǎn)是N端富含亮氨酸重復(fù)序列(LRRs)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有Toll/IL-1R同源區(qū)(TIR)，Toll樣受體在大部分免疫細(xì)胞中都有表達(dá)，能夠識(shí)別外源性配體(如細(xì)菌的脂多糖、胞壁酸、肽聚糖以及細(xì)菌和病毒的核酸等)和內(nèi)源性配體(宿主細(xì)胞在組織損傷或者應(yīng)激下釋放的多種蛋白如融合蛋白、纖維連接蛋白、纖維蛋白原、熱休克蛋白以及透明質(zhì)酸等)，TLR4主要識(shí)別LPS或內(nèi)毒素，TLR2主要識(shí)別LTA、PGN，在與配體識(shí)別后構(gòu)象改變，將信號(hào)傳遞至下游。NLRs有NACHT和LRR兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，當(dāng)PAMP與LRR結(jié)合后，NLR構(gòu)象改變，暴露出NACHT結(jié)構(gòu)域，NLR分子N端的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與激酶或caspase結(jié)合后開始活化。

3.1.1免疫細(xì)胞EVs激活Toll樣受體信號(hào)通路 Lee[6]將ARDS小鼠分為非感染組(高氧和鹽酸)和感染組(LPS和肺炎球菌)，處死后提取BALF中的EVs發(fā)現(xiàn)感染組EVs主要來源于肺泡巨噬細(xì)胞,非感染組EVs來源于肺上皮細(xì)胞，為研究EVs的功能，分別將提取出的EVs注射進(jìn)健康小鼠氣管內(nèi)，發(fā)現(xiàn)感染組肺泡巨噬細(xì)胞的TLR6、TLR9、CD80、IL-1β和IL-10基因表達(dá)上調(diào)，非感染組EVs刺激巨噬細(xì)胞TLR2、IL-6、TNF-α表達(dá)增加，而且除肺炎鏈球菌外，高氧、鹽酸、LPS、肺炎假單胞菌刺激產(chǎn)生的EVs都上調(diào)了巨噬細(xì)胞MyD88基因的表達(dá)，并且TLR2和TLR6都是NF-κB的重要受體，表明EVs可以通過TLRs-MyD88-NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑刺激巨噬細(xì)胞在肺內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

LPS與單核/巨噬細(xì)胞上的TLR4結(jié)合，可以釋放大量的TNF-α和IL-1β，但在同等條件下，人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞卻基本不釋放TNF-α和IL-1β，主要是以IL-6、IL-8、ICAM-1和選擇素E等中性粒細(xì)胞趨化因子為主[15]。有人[16]同時(shí)用肺內(nèi)皮細(xì)胞EVs和LPS處理小鼠模型，導(dǎo)致肺和全身IL-1β和TNF-α水平升高，中性粒細(xì)胞的募集和組織MPO水平的提高。用TNF-α體外刺激人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HLMVEC)和小鼠內(nèi)皮細(xì)胞(MLEC)后釋放出的EVs會(huì)激活NF-κB和PPAR介導(dǎo)的ICAM-1途徑，促進(jìn)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[17-18]。與之相似的是Soni[19]在用LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠BALF中提取巨噬細(xì)胞EVs，將巨噬細(xì)胞EVs在體外與小鼠上皮細(xì)胞培養(yǎng)4 h后,檢測(cè)到上皮細(xì)胞分泌的ICAM-1和KC(也叫CXCL-1)含量增加，在培養(yǎng)液中加入TNF抗體后ICAM-1表達(dá)受抑制，說明肺泡巨噬細(xì)胞EVs中的腫瘤壞死因子參與介導(dǎo)了肺上皮細(xì)胞炎癥的表達(dá)。研究者發(fā)現(xiàn)人血小板可以通過激活內(nèi)皮細(xì)胞直接參與內(nèi)毒素所引起的炎癥反應(yīng)，血小板分泌的EVs中含有成熟的IL-1β，依賴TLR4途徑誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1的表達(dá)增加[20]。

3.1.2免疫細(xì)胞EVs激活NLRP3炎癥小體 NLRP3炎癥小體是一種蛋白復(fù)合物，由NLRP3受體、銜接蛋白ASC和pro-caspase1組成，炎癥小體被激活后，ASC構(gòu)象改變，激活pro-caspase1，活性caspase-1釋放白介素1家族蛋白，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-1β。在炎癥反應(yīng)中，巨噬細(xì)胞上的TLR4識(shí)別病原體后，產(chǎn)生IL-1β前體，同時(shí)巨噬細(xì)胞識(shí)別損傷細(xì)胞釋放的ATP，通過NLRP3炎性小體激活caspase-1，使IL-1β前體轉(zhuǎn)變?yōu)镮L-1β參與炎癥反應(yīng)[21]。EVs可以調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體，參與ARDS的炎癥反應(yīng)過程。Zhang在LPS氣道滴注后的ARDS小鼠BALF中發(fā)現(xiàn)升高的EVs主要來源于巨噬細(xì)胞，同時(shí)在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中EVs含有的miR-223/142均大量增加，在抑制炎癥方面miR-223和miR-142分別通過抑制NLRP3和ASC，協(xié)同抑制巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化[22]。

有研究者對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠ARDS模型的BALF進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其EVs所含有的miRNA-466家族表達(dá)增加。隨后他們將含有miRNA-466g和466m-5p基因轉(zhuǎn)染到小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞(BMDMs)，一組用LPS和ATP刺激骨髓源性巨噬細(xì)胞，另一組在此基礎(chǔ)上予以NLRP3抑制劑，證實(shí)miRNA-466家族是通過激活NLRP3炎癥小體來加重ARDS的肺內(nèi)炎癥[23]。除此之外，Haneklaus等研究者發(fā)現(xiàn)miR-223和miR-BART15可以調(diào)節(jié)EB病毒感染的小鼠NLRP3炎癥小體和IL-1β的產(chǎn)生，主要表現(xiàn)為miR-223可以靶向與NLRP3 3’UTR結(jié)合，限制單核細(xì)胞炎癥小體激活，miR-223的過度表達(dá)阻止了NLRP3蛋白的積累，并抑制炎癥細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β；其次miR-BART15與NLRP3 3’UTR具有相同靶向位點(diǎn)，通過已感染的B細(xì)胞釋放包含miR-BART15的外泌體來抑制非感染細(xì)胞的NLRP3炎癥小體[24]。

3.2 免疫細(xì)胞EVs激活JAK-STAT信號(hào)通路JAK-STAT信號(hào)具有轉(zhuǎn)導(dǎo)多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的作用，其機(jī)制主要為JAKs和STATs的酪氨酸磷酸化，隨后以二聚體形式轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核調(diào)節(jié)特定DNA序列表達(dá)，而大多數(shù)STAT相關(guān)基因具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)的功能。革蘭陰性桿菌產(chǎn)生的LPS通過激活STAT3信號(hào)導(dǎo)致急性肺損傷，研究者用小分子STAT3抑制劑LLL12發(fā)現(xiàn)在LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠模型中LLL12不但抑制STAT3的激活，同時(shí)也抑制多種炎癥因子的表達(dá)如IL-1β、IL-6、TNF-α等[25]。相反的是SOCS中的蛋白會(huì)通過抑制JAK蛋白的磷酸化負(fù)調(diào)節(jié)JAK-STAT信號(hào)系統(tǒng)[26]，Bourdonnay報(bào)道巨噬細(xì)胞在外泌體和微泡中分別分泌SOCS1和SOCS3，經(jīng)肺泡上皮細(xì)胞攝取吸收后抑制STAT活化[27]。

3.3 免疫細(xì)胞EVs激活Rho/ROCK信號(hào)通路Rho/ROCK信號(hào)通路通過Rho與GTP結(jié)合激活下游ROCK，使ROCK底物磷酸化，調(diào)節(jié)內(nèi)皮及組織細(xì)胞通透性、收縮及生長(zhǎng)作用。Moon[28]提取高濃度氧誘導(dǎo)的ARDS小鼠BALF后發(fā)現(xiàn)，來源于肺泡上皮細(xì)胞的EVs中Caspase-3可以激活肺泡巨噬細(xì)胞的炎癥表達(dá)，而EVs中升高的Caspase-8蛋白對(duì)IL-6、TNF-α和MIP-2沒有顯著影響，和Caspase-3也不存在協(xié)同作用。為了研究其具體機(jī)制，研究者分別加入p38、MAPK、ROCK1和JNK抑制劑，發(fā)現(xiàn)只有ROCK1抑制劑可持續(xù)抑制肺泡巨噬細(xì)胞中IL-6、TNF-α和MIP-2的分泌。從而確定源于肺泡上皮細(xì)胞的EVs中caspase-3主要是通過ROCK1途徑激活肺泡巨噬細(xì)胞。

3.4 免疫細(xì)胞EVs參與ARDS凝血改變機(jī)制在ARDS和膿毒癥等嚴(yán)重肺內(nèi)感染常伴隨體內(nèi)凝血功能改變及微血栓形成，肺泡巨噬細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及血小板的EVs都不同程度的參與了凝血過程。目前認(rèn)為含有組織因子的EVs介導(dǎo)凝血改變是通過經(jīng)典的外源性凝血途徑(TF-FVIIa復(fù)合物-FXa-FIIa-FIa)和外源性凝血的替代途徑(依賴P選擇素途徑)這兩種路徑實(shí)現(xiàn)的[29]。Falati[30]發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞來源的EVs在血小板P選擇蛋白和PSGL-1介導(dǎo)下相互作用激活血小板聚集。P選擇蛋白和PSGL-1是血管粘附分子，白細(xì)胞釋放的EVs中所含有的組織因子和PSGL-1可以在損傷的血管壁上聚集并參與血小板血栓形成[31]。研究者發(fā)現(xiàn)源自于肺泡上皮細(xì)胞的EVs中包裹的組織因子是ARDS病理過程中促進(jìn)凝血活性的主要來源，在ARDS中肺泡上皮細(xì)胞可通過釋放含有組織因子的EVs促進(jìn)肺內(nèi)凝血，并由此推測(cè)這種改變可能與ARDS中肺泡內(nèi)纖維蛋白形成以及后續(xù)的纖維蛋白沉積有關(guān)[32]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)血漿中組織因子也來源于血小板釋放的EVs，血小板EVs的表面積與血小板相差巨大，但是促凝血活性幾乎等同于血小板，主要原因是EVs單位面積上結(jié)合的磷脂酰絲氨酸、CD61、CD62P和FX的密度是活化血小板的數(shù)倍[33]。

4 總結(jié)

EVs 的發(fā)現(xiàn)代表了一種新的細(xì)胞間通訊模式，在ARDS中參與著炎癥信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控，本文著重介紹ARDS的炎癥反應(yīng)和信號(hào)通路中病原微生物以及先天固有免疫細(xì)胞的各EVs所扮演的角色，實(shí)際上EVs在ARDS中的作用遠(yuǎn)不止于此，了解了EVs在ARDS病理過程中的作用，為今后疾病的診斷及治療中提供理論依據(jù)。