孫華利 毛森林 王心悅 王毅飛 付 錦△

1）哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150000 2）哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150000

腦卒中是一種突然起病的腦血液循環(huán)障礙性疾病，是導(dǎo)致認知障礙、殘疾和死亡的主要原因［1］。腦卒中包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中大多數(shù)是缺血性腦卒中，由于腦動脈血栓或栓塞堵塞，導(dǎo)致腦部血液循環(huán)障礙，缺血、缺氧所致的局限性腦組織的缺血性壞死或軟化，引起一系列復(fù)雜的病理生理反應(yīng)，其中包括突觸和突觸外谷氨酸的積累，離子通道功能紊亂等，最終導(dǎo)致神經(jīng)元細胞死亡和缺血性腦損傷。

目前公認的治療腦卒中的方法包括靜脈溶栓（包括組織纖溶酶原激活劑、尿激酶等）和動脈機械取栓術(shù)，其目的是使閉塞血管內(nèi)得到再灌注［2-3］。然而再灌注時可能會出現(xiàn)腦出血的風險，且由于治療時間窗有限，這兩種治療方法僅適用于一小部分腦卒中的患者。因此，尋找更安全的治療腦卒中藥物依然是醫(yī)學(xué)上的一大需求。

腦卒中后大腦中的神經(jīng)元死亡是一個活躍且持續(xù)時間較長的過程，了解潛在的死亡信號機制可將卒中損害降至最低，目前研究最深入的缺血性細胞死亡機制之一是興奮性毒性［4］。谷氨酸作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在缺血性腦卒中期間發(fā)揮重要的作用。由于缺乏穩(wěn)定的血液流動，大腦缺氧，神經(jīng)元無法維持正常的離子梯度電位，導(dǎo)致大量神經(jīng)遞質(zhì)釋放，特別是谷氨酸鹽［5］，谷氨酸在細胞外間隙大量積聚，導(dǎo)致突觸后神經(jīng)元谷氨酸受體過度激活，引起神經(jīng)元的損傷。

谷氨酸主要通過結(jié)合兩個受體揮作用，即離子型和代謝型受體。離子型谷氨酸受體是配體門控離子通道包括N-甲基D-天冬氨酸受體（NMDARs）、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體（AMPARs）和紅藻氨酸受體（KAR）。NMDA、AMPA受體通過允許離子（主要是Ca2+離子）進入細胞，介導(dǎo)谷氨酸的快速興奮作用。同時紅藻氨酸受體通過允許鈉和鉀離子通過細胞膜來發(fā)揮其功能［6］。在興奮性毒性中過量的谷氨酸釋放會導(dǎo)致離子型谷氨酸受體的過度激活，從而導(dǎo)致鈣離子的不斷涌入。Ca2+離子的異常內(nèi)流觸發(fā)多種鈣調(diào)節(jié)過程，如蛋白酶、核酸內(nèi)切酶、NO 合成酶的激活、自由基的產(chǎn)生和線粒體膜的破壞［6］等一系列下游促死亡信號反應(yīng)。在離子型谷氨酸受體家族中，NMDAR 在介導(dǎo)Ca2+離子內(nèi)流方面是最有效的，因此其拮抗劑被廣泛認為是潛在的神經(jīng)保護劑［7］。代謝型谷氨酸受體是G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs），通過其下游信號級聯(lián)發(fā)揮作用，介導(dǎo)較慢的神經(jīng)傳遞，主要起調(diào)節(jié)作用［6］。

代謝型谷氨酸受體1（mGluR1）是腦卒中相關(guān)研究中的另一種谷氨酸受體。由于NMDAR和mGluR1都位于突觸后膜上，因此有可能形成相互作用［6］。研究發(fā)現(xiàn)使用小鼠tMCAO 模型，干擾肽（TATmGluR1 T871-N885 或 TAT-mGluR1P1062-L1085）作用于mGluR1 -NMDAR 蛋白復(fù)合物，可降低梗死程度，具有神經(jīng)保護作用［6］。其他報告也表明mGluR1 的拮抗劑可以預(yù)防卒中動物模型中的神經(jīng)元損傷［8-9］。

NMDA型谷氨酸受體介導(dǎo)的興奮性毒性一直是腦卒中研究的熱點。許多重要的神經(jīng)功能包括突觸可塑性、記憶形成、情緒控制、大腦發(fā)育和神經(jīng)元存活都需要NMDAR 的生理活性。本文著重介紹了NMDAR 激活在腦卒中的雙重作用、潛在機制，以及基于NMDAR信號通路治療腦卒中的最新發(fā)現(xiàn)。

1 NMDA受體在神經(jīng)元存活和死亡中的雙重作用

NMDAR 是四聚體組合體，包括兩個GluN1 和兩個GluN2亞基，分別與共晶體甘氨酸和谷氨酸結(jié)合。GluN2 亞型（GluN2A、GluN2B、GluN2C 和GluN2D）及GluN3A 和GluN3B 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中都具有不同的性質(zhì)和表達模式［10］。雙重作用可能取決于被激活的受體的亞型。“NMDAR 亞型”假說指出，激活含GluN2A 的NMDARs 導(dǎo)致神經(jīng)元存活和對缺血損傷的神經(jīng)保護，而激活含GluN2B的NMDARs可導(dǎo)致興奮性毒性和神經(jīng)元凋亡［11-12］。在成人大腦中含GluN2B 的NMDAR 在突觸外部位富集，而含GluN2A的NMDAR在突觸高度表達。此外，GluN2C、GluN2D以及GluN3A和GluN3B亞基在介導(dǎo)神經(jīng)元存活和死亡方面發(fā)揮重要作用，如在大腦中動脈閉塞（MCAO）卒中動物模型中敲除GluN3A 基因小鼠梗死體積明顯大于野生型（WT）小鼠［13］。對于NMDA 受體亞型的研究為缺血性卒中提供了新的治療方法。NMDAR 在神經(jīng)元存活和死亡中的雙重作用可能取決于被激活的受體的亞型。

2 基于NMDAR受體的干預(yù)措施

2.1 NMDAR 受體拮抗劑與激動劑 最新研究發(fā)現(xiàn)，在大腦中動脈閉塞（MCAO）模型中，NMDAR 拮抗劑（MK801）僅對小鼠行為有藥理作用，未能顯示出對腦梗死的神經(jīng)保護作用［14］。但并不能克服NMDAR 拮抗劑在許多缺血動物模型（包括MCAO模型）中具有強烈神經(jīng)保護作用的廣泛證據(jù)［7,15-16］，特別是已開發(fā)出含有GluN2B 的NMDAR 特異性拮抗劑（CP-101,606），研究證明其對卒中損傷有效［17］。然而，由于治療時間窗有限、不良反應(yīng)嚴重或缺乏臨床療效，這些或類似藥物的臨床試驗令人失望［18］。近年來，在低pH 下作用的pH 敏感拮抗劑被開發(fā)出來，可以在缺血區(qū)特異性靶向含GluN2B的NMDAR。與傳統(tǒng)NMDAR 抑制劑（如氯胺酮和ro25-6981）相比，該拮抗劑家族的一個主要候選基因93-31 在tMCAO 小鼠中獲得類似的神經(jīng)保護效果和較少的不良反應(yīng)［19］。這種新一代含GluN2B 的NMDAR 拮抗劑可能對卒中患者更具耐受性。然而，這種基于拮抗劑的化合物可能仍然遭受與傳統(tǒng)含GluN2B 的NMDAR 拮抗劑相同的短治療窗口，因此，如果給藥太晚（即在執(zhí)行GluN2B 依賴程序細胞死亡信號通路之后），則不能對抗下游細胞死亡信號。

相比之下，增強含GluN2A的NMDA受體可促進細胞存活。最近開發(fā)出GluN2A 特異性正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑（PAM）［20］，包括GNE-6901。這些新的GluN2A 特異性PAM 通過激活神經(jīng)元存活信號保護神經(jīng)元免受興奮性毒性，比傳統(tǒng)的NMDAR拮抗劑具有更長的治療時間和更少的不良反應(yīng)。因此，選擇性增強含GluN2A 的NMDAR，相對于阻斷NMDAR，是卒中的一種更有前途的治療方法。

2.2 靶向NMDAR 促死亡途徑：NDC（死亡信號復(fù)合物）中的相關(guān)蛋白

2.2.1 GluN2B-PSD95-nNOS 復(fù) 合 物：GluN2B -PSD95-nNOS 信號復(fù)合物是神經(jīng)元死亡信號蛋白與GluN2BRs形成蛋白復(fù)合物，在這個復(fù)合物中，PSD95作為支架蛋白將nNOS（神經(jīng)元型一氧化氮合酶）與NMDA受體組裝在一起［21］。其中干擾興奮性毒性中NO 生成的一種方法是使用干擾肽（Tat-NR2B9c）結(jié)合PSD95或nNOS，從而干擾NMDAR激活nNOS的能力。這種肽可降低顱內(nèi)動脈瘤血管內(nèi)修復(fù)患者的醫(yī)源性缺血性腦梗死發(fā)生率［22］。由于它僅針對NMDAR-nNOS信號通路，因此其不良反應(yīng)要比在細胞表面阻斷NMDAR 的傳統(tǒng)抑制劑小得多。但最新研究表明，Tat-NR2B9c在dMCAO模型中不能預(yù)防腦梗死［14］。相關(guān)報道顯示［23］，在動物模型中小分子化合物（ZL006）可以阻斷nNOS-PSD-95 的結(jié)合，改善大腦中動脈閉塞（MCAO）或再灌注引起的局灶性腦缺血損傷。

2.2.2 GluN2B-DAPK1-p53 復(fù)合物：死亡相關(guān)蛋白激酶1（DAPK1）是一種鈣離子/鈣調(diào)素（CaM）依賴的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其活性與凋亡細胞死亡相關(guān)［24］。已有報告稱，DAPK1 基因的缺失或給予藥物（如Tat-NR2BCT）破壞GluN2B-DAPK1 相互作用可以保護小鼠免受卒中損傷［25］，且使用DAPK1-p53阻斷劑Tat-p53DM對OGD誘導(dǎo)的細胞凋亡和壞死具有高度的神經(jīng)保護作用［26］。

2.2.3 GluN2B NMDAR-PTEN：抑癌基因PTEN（在10 號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物）具有脂類和蛋白質(zhì)磷酸酶活性，PTEN的基因敲除在腦缺血中具有神經(jīng)保護作用［27］。NMDA的興奮毒性可導(dǎo)致神經(jīng)元中PTEN核易位，大鼠局灶性缺血模型證明Tat-K13 不僅可以減少缺血誘導(dǎo)的PTEN核易位，也可以有效地防止缺血性腦損傷［28］，即使在卒中后6 h應(yīng)用也是有效的［28］。

2.2.4 NMDAR-Src-Panx1 complex：體外和體內(nèi)的缺血性卒中模型證明NMDAR 通過一種不需要受體離子通道的機制導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。這種機制需要配體結(jié)合，但與NMDARs 中的Ca2+內(nèi)流無關(guān)。WEIL?INGER 等［29］報告了一種由NMDARs、肉瘤（Src）激酶和pannexin-1（Panx1）通道組成的信號復(fù)合物的存在，這種復(fù)合物與膜泡形成、Ca2+失調(diào)、線粒體功能障礙和細胞死亡以及卒中后的神經(jīng)功能缺損有關(guān)。使用干擾肽Tat-panx308 阻斷Panx1 C 端的Y308 位點，可以減少MCAO 后的梗死面積，具有神經(jīng)保護作用［29］。

2.2.5 DLK（雙亮氨酸拉鏈激酶）：在成熟的神經(jīng)元中DLK 存在于突觸中，并與多種已知的突觸后密度蛋白（包括支架蛋白PSD-95）相互作用。DLK 基因敲除減弱了JNK/c-Jun應(yīng)激反應(yīng)途徑的活化，降低了紅藻氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性病變的水平［30］。最近人們發(fā)現(xiàn)了一種有效的DLK選擇性抑制劑GNE-3511，其在神經(jīng)退行性病變和神經(jīng)毒性的體內(nèi)模型中具有神經(jīng)保護作用［31-32］。

3 靶向NDC（死亡信號復(fù)合物）下游的死亡信號蛋白

NMDAR 介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)元死亡的新靶點不僅局限于NDC，還包括NDC 下游的死亡信號蛋白。（1）鈣蛋白酶（Calpains）：鈣依賴性半胱氨酸蛋白酶Calpain 參與NMDAR 介導(dǎo)的興奮毒性，激活Calpain可以誘導(dǎo)細胞死亡，且Calpain 還介導(dǎo)Kidins220/ARMS 下調(diào)［33］、紋狀體富集蛋白酪氨酸磷酸酶（STEP）［34］以及代謝型谷氨酸受體1（mGluR1）［35］的裂解。阻斷這些下游死亡信號蛋白可提供更寬的治療時間窗，即使在卒中后6 h 給予治療，Calpain 抑制劑SNJ-1945 在小鼠腦缺血中也顯示出神經(jīng)保護作用［36］，并且Tat-K（干擾Calpain 介導(dǎo)的Kidins220的裂解［37］）、Tat STEP（干擾calpain 介導(dǎo)STEP［34］的裂解）和TatmGluR1（干擾Calpain 介導(dǎo)的mGluR1 的裂解［35］）也能夠防止體外和體內(nèi)興奮性毒性導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡。（2）促分裂原激活蛋白激酶（MAPKs）：MAPKs 蛋白家族中p38 和c-Jun 氨基末端激酶（JNK）在興奮毒性期間被激活［38］，介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。p38 抑制劑（SB-203580 和SB-239063）和JNK抑制劑（TatJBD20）可防止體外和體內(nèi)腦卒中模型中NMDAR 介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡［38-40］。即使在卒中發(fā)作后6 h 或12 h 給予藥物治療，也具有神經(jīng)保護作用［40］。（3）甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）：神經(jīng)元中的甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（SREBP-1）轉(zhuǎn)錄因子的激活在卒中體外和體內(nèi)模型中NMDAR 介導(dǎo)的興奮性毒性神經(jīng)元死亡中起重要作用，Insig-1 衍生干擾肽（Indip）已被開發(fā)用來阻斷SREBP 的核轉(zhuǎn)位，使用MCAO模型證實了其對卒中損傷的治療潛力［41］。（4）α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體（AMPARs）的內(nèi)吞作用：AMPAR 的內(nèi)吞作用對N-甲基-D-天冬氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡至關(guān)重要，使用干擾肽可以特異性抑制AMPAR 內(nèi)吞作用，具有神經(jīng)保護作用［42］。

4 總結(jié)與展望

NMDAR在神經(jīng)元存活和死亡中的雙重作用，總結(jié)NMDAR 最新研究進展，更好地解釋了NMDAR 拮抗劑應(yīng)用在臨床中失敗的原因，并且對于開發(fā)基于NMDAR 的更有效的神經(jīng)保護藥物提供了更好的科學(xué)基礎(chǔ)。此外，作用于NMDAR下游死亡信號蛋白質(zhì)的干擾肽也被開發(fā)出來，這些干擾肽能夠特異性地抑制下游死亡信號而不影響受體的其他功能信號，比傳統(tǒng)NMDAR阻滯劑的不良反應(yīng)小，且具有更寬的治療時間窗口，為臨床治療腦卒中提供了更有效的新療法。