毛鑫羽,黃宇虹,王保和

隨著藥物研究與開發(fā)的不斷發(fā)展,藥物的安全性問題愈來愈受到關(guān)注,藥物安全性的相關(guān)基礎(chǔ)研究廣泛開展。雖然大部分藥物上市后被證實(shí)安全有效,但仍有部分藥物在臨床應(yīng)用的安全方面存在隱患[1]。要正視藥物的毒性,選用合適的生物毒性模型,用科學(xué)客觀的數(shù)據(jù)對藥物的毒性進(jìn)行正確評價(jià)。

藥物毒性主要體現(xiàn)在對心、肝、腎等主要臟器的損害方面,其中藥物心臟毒性是指藥物在相對小的劑量和相對短的時(shí)間內(nèi)對心臟生理功能產(chǎn)生影響或損害心肌的藥效反應(yīng)[2]。心臟毒性反應(yīng)多會(huì)導(dǎo)致心肌病的發(fā)生,嚴(yán)重影響心肌及心臟電生理功能[3],心臟安全性是藥物研發(fā)階段臨床應(yīng)用前及上市前后需要持續(xù)考量的重要指標(biāo),如何詳細(xì)全面地評價(jià)藥物心臟安全性、正確認(rèn)識(shí)藥物心臟毒性,是藥物安全性評價(jià)的重點(diǎn)[4]。

在廣泛開展的藥物安全性評價(jià)基礎(chǔ)研究中,模型的建立是進(jìn)行進(jìn)一步醫(yī)學(xué)試驗(yàn)和假說的基礎(chǔ),具有不可替代的重要意義,掌握藥物心臟毒性的臨床試驗(yàn)前篩選技術(shù),找到能夠快速、準(zhǔn)確、敏感地反映外源性化合物對生物體毒性作用的評價(jià)模型已經(jīng)成為藥物安全性評價(jià)亟待解決的重要問題[5-6]。現(xiàn)對藥物心臟毒性模型的建立與評價(jià)進(jìn)行綜述。

1 體外模型

1.1 離體心臟 離體大鼠心臟模型已經(jīng)廣泛用于心臟缺血再灌注損傷等相關(guān)研究,或應(yīng)用于監(jiān)測藥物對心臟功能和節(jié)律的影響等研究中。Robert[7]建立了離體大鼠心臟的短期模型,通過左室壓反映藥物的心臟毒性。1895 年德國生理學(xué)家Oscar Langendorff 首次成功制備了哺乳動(dòng)物的離體心臟灌流裝置[8],命名為Langendorff 離體心臟灌流模型。K-H 灌流液經(jīng)由主動(dòng)脈根部灌注冠狀動(dòng)脈循環(huán),從冠狀靜脈竇流入右心房,與生理狀態(tài)下的血液灌流方向相反[9]。正常情況下,大鼠立體心臟經(jīng)Langendorff 裝置灌流后數(shù)秒即可恢復(fù)自主搏動(dòng),20 min 左右心室內(nèi)壓趨于穩(wěn)定,心率及節(jié)律穩(wěn)定,偶爾發(fā)生心律失常[10]。通過建立穩(wěn)定的Langendorff 離體心臟灌流模型,應(yīng)用潛在毒性藥物對其進(jìn)行干預(yù),對離體心臟的心率、PR 間期、QT 間期等心電圖指標(biāo)進(jìn)行記錄,觀察發(fā)生心律失常的風(fēng)險(xiǎn),以評價(jià)藥物的心臟安全性。離體心臟灌注模型具有可重復(fù)性強(qiáng)、敏感性高等特點(diǎn),廣泛應(yīng)用于心血管領(lǐng)域基礎(chǔ)研究中,但離體心臟模型的制備受灌注液、灌注壓力、流量及灌注操作等多種主觀因素影響,不易標(biāo)準(zhǔn)化[11],且嚙齒類動(dòng)物及犬等動(dòng)物的心臟結(jié)構(gòu)、電生理以及遺傳學(xué)相關(guān)因素與人類的差異,使其不能完全準(zhǔn)確預(yù)測藥物對人體潛在的心臟毒性,具有一定的局限性[12-14]。

1.2 人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞 既往采用人類ether-a-go-go 相關(guān)基因(hERG)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293 細(xì)胞系作為評價(jià)藥物心臟毒性的體外細(xì)胞模型[15],而心肌細(xì)胞由于具有部分電生理特性且操作簡便的特點(diǎn),如今被廣泛應(yīng)用于藥物心臟安全性評價(jià)方面。來源于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,hiPSC-CMs)表達(dá)肌絲蛋白,具有與原代心肌細(xì)胞相類似的電生理特性,并且表達(dá)多個(gè)與人心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位相關(guān)的離子通道,為藥物心臟毒性的評價(jià)提供了新的體外模型[16-18]。通過對hiPSC-CMs 的長期體外培養(yǎng),可以檢測出引起藥物心臟毒性的多條可能途徑及機(jī)制,包括引起氧化應(yīng)激、線粒體損傷、改變細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路、改變Ca2+調(diào)節(jié)等[19-20]。可以通過hiPSCCMs 模型檢測藥物的心臟電生理毒性、結(jié)構(gòu)性毒性等,為藥物安全性監(jiān)測提供了細(xì)胞水平的模型。

干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞在藥源性心臟毒性體外評價(jià)研究中應(yīng)用廣泛。相對于原代大鼠心肌細(xì)胞,人誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞作為藥物的心臟毒性評價(jià)模型更為準(zhǔn)確敏感。有研究者通過對比原代大鼠心肌細(xì)胞與hiPSC-CMs 兩種細(xì)胞模型,以探尋更優(yōu)的心臟毒性體外評價(jià)模型。通過應(yīng)用RTCAxCELLigence技術(shù)對細(xì)胞的不規(guī)律搏動(dòng)頻率或振幅進(jìn)行監(jiān)測,同時(shí)運(yùn)用高內(nèi)涵細(xì)胞成像法在給藥后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測線粒體膜電位,并觀察不同濃度藥物對原代大鼠心肌細(xì)胞及hiPSC-CMs 的影響,證實(shí)hiPSC-CMs 對藥物心臟毒性的評價(jià)更加敏感,在用藥早期、低濃度用藥時(shí)即可檢測到藥物對細(xì)胞的影響[21]。利用人胚胎干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞能夠建立一種可行的體外心臟毒性評價(jià)模型,通過聯(lián)合實(shí)時(shí)細(xì)胞分析法(real-time cell analysis cardio,RTCA Cardio)以及高內(nèi)涵細(xì)胞成像技術(shù),可連續(xù)動(dòng)態(tài)記錄細(xì)胞的增殖、毒性及細(xì)胞狀態(tài),對藥物的心臟毒性進(jìn)行快速、靈敏、準(zhǔn)確的評價(jià),并且可以作為一種高通量篩選工具用于臨床前藥物心臟毒性早期篩選[22-24]。

hiPSC-CMs 與成熟心室肌細(xì)胞存在些許差異,主要表現(xiàn)在成熟度方面。hiPSC-CMs 高表達(dá)超極化激活環(huán)核苷酸門控通道及L 型鈣通道,低表達(dá)內(nèi)向整流型鉀離子通道2.1(Kir2.1)及鈉通道,動(dòng)作電位去極化速度較成熟心室肌細(xì)胞減慢,時(shí)間略長[25-26]。Campbell等[27]通過誘導(dǎo)hiPSC 產(chǎn)生心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,將這幾種細(xì)胞按照人心臟中的比例共同培養(yǎng),完成了心臟立體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的構(gòu)建。Correia 等[28]也通過一種全新的培養(yǎng)模式建立了高純度hiPSC-CMs 立體聚集體模型,并證實(shí)相比于平面培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,立體細(xì)胞模型在細(xì)胞間相互作用等對各方面基因表達(dá)有明顯的影響,提示hiPSC-CMs 立體模型對藥物評價(jià)方面有更準(zhǔn)確的預(yù)測及參考價(jià)值。應(yīng)用人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化獲得的心肌細(xì)胞可以減少不必要的動(dòng)物實(shí)驗(yàn),同時(shí)可以高通量評價(jià)藥物對心臟功能性和結(jié)構(gòu)性的影響[18],將純度更高、成熟度更高的hiPSC-CMs 及心臟立體培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于藥物的研發(fā)及早期安全性評價(jià),可以很大程度上降低藥物研發(fā)成本,減少種屬差異,增加對藥物心臟毒性預(yù)測的敏感性與準(zhǔn)確性,并即將成為臨床前藥物心臟安全性評價(jià)的重要體外模型[29-30]。

2 動(dòng)物模型

目前,動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)對象主要包括大鼠、小鼠、兔等,主要目的是尋求與人類結(jié)構(gòu)和發(fā)病過程相似的動(dòng)物模型,便于更好地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究?，F(xiàn)已建立了大鼠或小鼠、兔、豬、犬和斑馬魚等用于預(yù)測藥物心臟毒性的模型,這些模型已用于藥物臨床前毒性的評價(jià)。

2.1 鼠、兔 大鼠、小鼠及家兔等嚙齒類動(dòng)物是當(dāng)前藥物安全性評價(jià)在體模型主要用到的實(shí)驗(yàn)對象,可以通過兔耳緣靜脈注射阿霉素2 mg/kg 建立早期心臟毒性模型,或通過腹腔注射阿霉素法復(fù)制大鼠心臟毒性模型,采用梯度劑量間隔給藥造模[31-33],其中張珊等[34]采用阿霉素誘導(dǎo)大鼠心臟毒性模型,鹽酸阿霉素2.5 mg/kg 對大鼠少量多次腹腔注射,每周1 次,累積總藥量15 mg/kg。亦有研究者通過多柔比星(DOX)4 mg/kg小鼠腹腔注射建立心臟毒性模型[35]。

通過大鼠或小鼠、兔等嚙齒類動(dòng)物建立藥物體內(nèi)心臟毒性模型,飼養(yǎng)方便,易于復(fù)制,可完成藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄過程,與臨床上早期藥源性心臟毒性反應(yīng)相似,在藥物心臟毒性臨床前評價(jià)方面廣泛應(yīng)用,對早期藥源性心臟毒性的評價(jià)具有重要意義。

2.2 斑馬魚 近年來,斑馬魚在國內(nèi)外已成為一種熱門的藥學(xué)研究工具,被用來建立各種疾病模型進(jìn)行藥物活性、毒性的高通量篩選以及藥物代謝等方面的研究[36-37]。

張利軍等[38]選用斑馬魚的胚胎作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,對藥物的心臟毒性進(jìn)行評價(jià),通過高通量篩選建立藥物心臟毒性斑馬魚模型。研究以4 種已知心臟毒性陽性藥物作為試驗(yàn)藥物,通過觀察斑馬魚胚胎心血管系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)改變,測量靜脈竇-動(dòng)脈球(SV-BA)距離及心率來評價(jià)藥物心臟毒性作用的特點(diǎn),證明斑馬魚作為藥物心臟毒性評價(jià)模型的準(zhǔn)確性及可行性。趙夢嵐等[39]選用狀態(tài)好的48hpf(hours post fertilization)斑馬魚胚胎,設(shè)立低、中、高濃度烏頭堿進(jìn)行干預(yù),并采用0.1%二甲基亞砜(DMSO)作為陰性對照,于給藥后12 h、24 h、48 h 觀察斑馬魚胚胎的存活率、生長情況以及心臟舒縮功能,記錄斑馬魚胚胎的心包水腫情況以及心率、心排血量等各項(xiàng)心功能指標(biāo)。研究證實(shí)10 μmol/L 中等濃度劑量烏頭堿給藥48 h 后,斑馬魚胚胎心包水腫明顯,心臟舒縮功能障礙,具有明顯的心臟毒性,但不致其死亡,確立選用10 μmol/L 濃度烏頭堿干預(yù)斑馬魚胚胎建立早期心臟毒性模型,并于后續(xù)研究中應(yīng)用。徐卓然等[40]運(yùn)用64.4 μmol/L 阿霉素對24hpf 斑馬魚胚胎進(jìn)行干預(yù),建立斑馬魚心臟毒性模型,并對其機(jī)制進(jìn)行了探討。

斑馬魚模型克服了其他模式生物在研究中的局限和弊端,具有身體透明、基因同源、快速發(fā)育、體型微小、飼養(yǎng)便捷等特點(diǎn)[41],可以通過觀察藥物對斑馬魚的作用進(jìn)而預(yù)測其對人體的影響[42],使斑馬魚成為了藥物心臟毒性研究的理想動(dòng)物模型。

3 心臟毒性模型的評價(jià)

心臟毒性模型建立后,其模型的評價(jià)顯得尤為重要。細(xì)胞模型主要通過應(yīng)用RTCAxCELLigence 技術(shù)或高內(nèi)涵成像技術(shù)檢測線粒體膜電位來評價(jià)藥物對心臟毒性的影響,對于動(dòng)物模型目前主要采用以下幾個(gè)方面對心臟毒性模型的建立進(jìn)行評價(jià):①形態(tài)學(xué)觀察。斑馬魚心臟毒性模型可以通過顯微鏡以及熒光倒置顯微鏡觀察斑馬魚胚胎的狀態(tài)、心臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)、心臟收縮與舒張情況以及心包水腫情況等,對斑馬魚心臟損傷的表型進(jìn)行評估[39]。②心率及心功能監(jiān)測。動(dòng)物模型可以對大鼠、兔或斑馬魚的心率、心排血量、每搏量、血流動(dòng)力學(xué)等心功能指標(biāo)進(jìn)行檢測,反映藥物對心臟早期的毒性反應(yīng),更深入的研究可以通過熒光蛋白基因標(biāo)記實(shí)時(shí)監(jiān)控斑馬魚胚胎心臟發(fā)育過程中特定基因的表達(dá)情況及表達(dá)位置,以更準(zhǔn)確地定性、定量對藥物的心臟毒性進(jìn)行評價(jià)[40]。③超聲心動(dòng)圖。通過心肌背向散射積分技術(shù)及小動(dòng)物超聲儀器有效監(jiān)測模型的建立,評估模型的效果,將大鼠或小鼠麻醉脫毛后,通過Vevo2100(Visual Sonics Inc)儀器對其進(jìn)行心臟超聲檢查,檢測射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室縮短分?jǐn)?shù)(FS)、左室壓最大上升速率(+LVdp/dtmax)以及心臟構(gòu)型及血流的變化,評價(jià)藥物對心臟的毒性作用[31]。通過定量組織速度成像(QTVI)技術(shù)與小動(dòng)物超聲儀器對早期藥物心臟毒性模型的建立進(jìn)行評價(jià),可以根據(jù)QTVI參數(shù)的變化來調(diào)整造模過程中的用藥劑量,使建立的藥物心臟毒性模型的病理變化程度趨于一致[43]。根據(jù)不同的心臟毒性模型,選取相應(yīng)的方法對模型的建立及藥物的心臟毒性進(jìn)行評價(jià)。

4 小 結(jié)

藥源性心臟毒性作為各類藥物研發(fā)及臨床應(yīng)用階段需要考量的重要問題,對藥物心臟毒性的早期監(jiān)測十分重要,國內(nèi)外藥物毒性評價(jià)研究迅速發(fā)展,選取與人類心臟毒性反應(yīng)相似的動(dòng)物或細(xì)胞模型,建立適合的藥物心臟毒性評價(jià)模型,對藥物的心臟安全性評價(jià)具有重要的意義。

離體心臟模型可以清晰敏感地模擬藥物對心臟的毒性,易于觀察及早期發(fā)現(xiàn),但造模復(fù)雜、受操作影響不易標(biāo)準(zhǔn)化,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心臟結(jié)構(gòu)及電生理功能與人體相較有一定的差異;hiPSC-CMs 建立早期心臟毒性模型與人類心肌細(xì)胞具有相似的電生理特性,敏感性高,有利于高通量早期評價(jià)藥物的心臟毒性,且立體細(xì)胞模型對于評價(jià)藥物心臟毒性可能更加準(zhǔn)確,成熟度方面有待進(jìn)一步提高;嚙齒類動(dòng)物心臟毒性模型建立簡便,飼養(yǎng)方便,可以運(yùn)用超聲心動(dòng)圖對模型的建立進(jìn)行評價(jià),并可以通過測量結(jié)果調(diào)整造模過程中的用藥劑量;斑馬魚作為一種與人類基因同源的動(dòng)物,體型較小,身體透明,復(fù)制方便,建立藥物心臟毒性模型,可以直觀地對心臟結(jié)構(gòu)形態(tài)、舒縮狀態(tài)等情況進(jìn)行觀察,實(shí)時(shí)監(jiān)測藥物對斑馬魚心率及心功能的影響,進(jìn)而預(yù)測藥物對人體心臟安全性的影響,是較理想的心臟毒性模型動(dòng)物。根據(jù)心臟安全性評價(jià)需求,選取并建立合適的心臟毒性模型可以為新藥研發(fā)及藥物早期臨床應(yīng)用方面的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)與思路。