羅春芳 唐玉蘭

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種由免疫介導的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system)自身免疫性疾病，以脫髓鞘、神經(jīng)功能紊亂和進行性神經(jīng)變性為特征。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是MS理想的動物模型。在MS中，自身反應性T淋巴細胞穿過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應，導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘和斑塊形成，進而導致神經(jīng)功能障礙[1]。大量研究證明CD4+T細胞在MS發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，輔助性T細胞1(helper T cell，Th1)和Th17細胞參與了MS的發(fā)病過程，在EAE模型中調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)和細胞因子白介素10(interleukin 10，IL-10)是疾病發(fā)展的兩個重要負性調(diào)控因子，另外，Th2細胞的增多或Th1/Th17細胞的抑制可延緩EAE的進展[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類具有調(diào)控活性的內(nèi)源性非編碼小RNA，它參與多種生物體內(nèi)生理進程的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[2]。miRNA合成過程中需要Drosha和Dicer核酸酶，這兩種酶的特異性缺失會導致T細胞的發(fā)育、分化和細胞因子的產(chǎn)生出現(xiàn)異常，這提示miRNA可能對T細胞的發(fā)育和分化起著重要作用[3]。近年來，越來越多的動物研究表明，miRNA作為免疫應答和炎癥調(diào)控等不同生物學過程的關(guān)鍵調(diào)控因子，在MS發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。本文對MS和EAE免疫應答過程中CD4+T細胞的分類和作用進行綜述，重點闡述miRNA對CD4+T細胞分化和功能的調(diào)節(jié)作用。

1 CD4+T細胞亞群分類、基本作用及特點

CD4+T細胞在病原體的防御和維持免疫穩(wěn)態(tài)方面起著至關(guān)重要的作用。在抗原刺激下，初始CD4+T細胞被激活，增殖分化為各種Th效應細胞，包括Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞和Treg等。Th細胞亞群是引導免疫反應的關(guān)鍵因素，在適應性免疫應答中發(fā)揮重要作用。Th1細胞主要分泌干擾素-γ(interferon γ，IFN-γ)介導細胞免疫應答，在保護宿主免受特殊細胞內(nèi)病原體侵襲方面起著重要作用，Th1細胞過度活躍會導致組織損傷，引發(fā)不必要的炎癥性疾病和自身反應性疾??；Th2細胞主要分泌IL-4介導體液免疫應答，在抵抗細胞外病原體方面很重要；Th17細胞主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-21和IL-22等促炎因子，在誘導自身免疫和增殖中起關(guān)鍵作用；Treg細胞具有免疫抑制特性，主要分泌IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor β，TGF-β)，可通過細胞間相互作用抑制其他細胞亞群的激活，抑制免疫應答，維持自身免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)。

2 CD4+T細胞亞群在MS病程中的作用

目前普遍認為，CD4+T細胞協(xié)同其他免疫效應因子共同在MS的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，它們以中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘中的抗原為靶點，是MS炎癥的最初驅(qū)動因素。自身反應性T淋巴細胞在外周免疫系統(tǒng)活化增多，透過被破壞的血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，導致大量炎性細胞浸潤引發(fā)慢性炎癥，釋放炎性細胞因子和毒素導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘脫失和軸突變性，引起神經(jīng)傳導缺陷，此過程是MS臨床癥狀的基礎(chǔ)，在MS的發(fā)病過程中起著決定性作用[4]。由CD4+T細胞分化而來的Th細胞亞群和Th細胞分泌的細胞因子之間的平衡作用影響著MS的發(fā)生發(fā)展，Th1/Th17細胞擴增或Th2/Treg細胞減少都可能誘導MS的發(fā)?。患膊〉陌l(fā)生發(fā)展還涉及信號傳導途徑調(diào)節(jié)機制，如IFN-γ、IL-4和IL-12等細胞因子可通過調(diào)節(jié)激酶/信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)通路來控制Th1/Th2細胞的分化，進而調(diào)控免疫應答[5]。

Th1細胞是最早被發(fā)現(xiàn)在MS中具有致病性的細胞亞群，由初始CD4+T細胞在IL-12和IFN-γ的刺激下分化而來。信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子4(signal transducer and activation of transcription 4，STAT4)和STAT1對Th1的分化極其重要，IL-2激活STAT4轉(zhuǎn)錄信號，IFN-γ則激活STAT1轉(zhuǎn)錄信號，在強T細胞受體(T cell receptor，TCR)信號存在的情況下，IL-12/STAT4和IFN-γ/STAT1信號傳導途徑可誘導Th1特異性轉(zhuǎn)錄因子T細胞表達的T盒(T-box expressed in T cells，T-bet)使T-bet表達上調(diào)，進而放大IFN-γ/STAT1/T-bet信號，促進Th1細胞分化；而STAT5則直接增強IFN-γ的表達來促進Th1分化，導致IFN-γ分泌進一步增加[6]；而IFN-γ可調(diào)控中性粒細胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)募集，通過產(chǎn)生活性氧物質(zhì)破壞血腦屏障，促進MS的發(fā)展[7]。缺乏Th1型相關(guān)因子T-bet和STAT4的小鼠對EAE的發(fā)生具有抵抗力，而IFN-γ-/-、IFN-γR-/-和STAT1-/-型小鼠則加重EAE的癥狀[6]，這提示Th1細胞可通過不同的機制在EAE的發(fā)病過程中發(fā)揮作用。

Th2細胞主要分泌IL-4，同時IL-4也能刺激初始CD4+T細胞分化為Th2細胞，而Th2細胞的分化依賴于轉(zhuǎn)錄因子γ-氨基酸結(jié)合蛋白3(GATA binding protein 3，GATA3)和STAT6。產(chǎn)生IL-4的Th2細胞增加或者細胞從Th1型向Th2型免疫應答的轉(zhuǎn)移對Th1細胞具有拮抗作用，從而認為Th2細胞具有抗炎作用。但也有研究表明Th2細胞可引起臨床表現(xiàn)較為溫和的非典型EAE[8]。

Th17細胞由初始CD4+T細胞在IL-6或IL-21與TGF-β刺激下分化而來，Th17細胞能分泌一系列細胞因子，包括IL-17A、IL-17F、IL-21和IL-22，這些細胞因子可以招募和激活中性粒細胞和巨噬細胞，促進炎癥[9]。Th17細胞以表達轉(zhuǎn)錄因子維甲酸受體相關(guān)孤核受體α(retinoicacid-related orphan receptorα，ROR-α)、維甲酸受體相關(guān)孤核受體γt(retinoicacid-related orphan receptor γt，ROR-γt)和STAT3為特征，主要參與炎性疾病的介導，在MS中具有致炎作用。

Treg是初始CD4+T細胞在TGF-β刺激下分化而來的另一重要亞群，CD4+Treg包括多種類型，根據(jù)成熟部位的不同，CD4+Treg至少有兩種類型：胸腺自然產(chǎn)生的CD4+CD25+Treg(nTreg)及外周誘導產(chǎn)生的Treg(iTreg)。nTreg主要通過細胞接觸依賴性的方式抑制炎癥和免疫反應，iTreg則通過分泌抑制性細胞因子IL-10或TGF-β發(fā)揮免疫抑制作用[9]。另外，按表型和作用機制的不同，CD4+Treg還包括Ⅰ型調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory cell type 1，Tr1)、Ⅲ型輔助性T細胞(helpertype 3，Th3)和IL-10+/TGF-β+CD4+Treg細胞等類型。MS中的Treg異?？赡馨〝?shù)量的減少、抑制能力的喪失以及向中樞神經(jīng)系統(tǒng)遷移能力的缺陷，許多MS患者Treg中FoxP3表達降低，Treg抑制功能降低[10]。有研究表明，增加EAE小鼠體內(nèi)Treg的數(shù)量，可以抑制小鼠自身反應性T細胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的遷移和浸潤，顯著改善MOG誘導的EAE癥狀[11]。

3 miRNA調(diào)控CD4+T細胞分化

CD4+T細胞作為MS發(fā)病機制中的關(guān)鍵細胞，其分化機制一直是研究者們的關(guān)注點。已有大量研究證實miRNA可通過對某些特定基因發(fā)揮靶向作用，調(diào)控CD4+T細胞的分化和功能，參與Th細胞亞群的發(fā)育過程，同時調(diào)控多種信號通路，在MS和EAE的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。

3.1 對Th1/Th2細胞分化的調(diào)控大量研究發(fā)現(xiàn)MS中多種miRNA參與了Th1/Th2細胞的分化和功能，對于疾病的發(fā)生發(fā)展非常重要?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，MS患者幼稚CD4+T細胞中miR-128、miR-27b表達升高，MS患者記憶性CD4+T細胞中miR-340表達增加，其中miR-128和miR-27b能夠直接與B淋巴瘤Mo-MLV插入?yún)^(qū)1同源物(B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog，BMI1)和GATA3的mRNA相互作用并抑制兩者表達，miR-128還可抑制IL-4的表達；miR-340則與BMI1和IL-4的mRNA結(jié)合并抑制BMI1和IL-4表達，而抑制BMI1和IL-4的表達可使免疫應答反應平衡從Th2向Th1方向轉(zhuǎn)變，進而驅(qū)動MS的發(fā)病[12]。

Guan等[8]發(fā)現(xiàn)在EAE小鼠CD4+T細胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的浸潤單核細胞中致死因子7(lethal-7，let-7e)表達明顯上調(diào)，還發(fā)現(xiàn)let-7e能夠直接與IL-10和IL-13特異性結(jié)合，抑制兩者在血漿中的產(chǎn)生進而增強Th1的分化，加重EAE癥狀。體外沉默Let-7e可以抑制腦源性Th1，而使Th2細胞增加，EAE癥狀減弱；進一步用慢病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠使let-7e過表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Th1細胞分化增強，IFN-γ生成增加，EAE癥狀加重[8]。這些現(xiàn)象表明let-7e通過調(diào)控Th1和Th2細胞的分化參與EAE的發(fā)生發(fā)展。

miR-140-5p首先在軟骨細胞中被發(fā)現(xiàn)，與軟骨變性和骨化有關(guān)。Guan等[1]研究發(fā)現(xiàn)miR-140-5p在MS患者CD4+T細胞中表達水平明顯下調(diào)。該研究發(fā)現(xiàn)MS早期miR-140-5p的表達開始下降，隨著疾病的發(fā)展達到高峰，miR-140-5p的表達繼續(xù)下降；在MS緩解后，miR-140-5p的表達逐漸恢復到原來的水平，提示miR-140-5p的表達與MS的進展呈負相關(guān)。熒光素酶檢測發(fā)現(xiàn)miR-140-5p通過靶向STAT1，抑制STAT1的功能和表達，進一步抑制下游靶點T-bet的表達和激活，進而抑制Th1細胞的分化，降低IFN-γ的表達[1]。此外，有報道稱miR-140-5p還可通過線粒體呼吸途徑抑制Th1細胞的分化[5]。

研究表明miR-142a-5p可通過靶向作用于細胞因子信號傳導抑制物1(suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1)促進Th1細胞分化。當SOCS1缺失時，CD4+T細胞主要分化為Th1細胞。Talebi等[13]發(fā)現(xiàn)在MS患者腦組織和EAE小鼠脊髓中miR-142a-5p表達水平升高，而SOCS1表達降低；熒光素酶檢測顯示miR-142a-5p能夠直接靶向SOCS1進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，促使初始CD4+T細胞明顯向Th1細胞方向分化。

3.2 對Th17細胞分化的調(diào)控Th17細胞在MS/EAE的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，已有大量體內(nèi)和(或)體外研究發(fā)現(xiàn)許多miRNA介導Th17的分化，參與MS/EAE的發(fā)生發(fā)展。本文分別從促進分化和抑制分化兩方面來闡述miRNA對Th17細胞的調(diào)控作用。

3.2.1促進Th17細胞分化：Du等[14]發(fā)現(xiàn)miR-326是Th17細胞相關(guān)miRNA，與健康對照組和緩解期MS患者相比，miR-326的表達在復發(fā)期MS患者CD4+T細胞中明顯升高，提示mi-326與MS疾病嚴重性相關(guān)。在EAE模型中發(fā)現(xiàn)miR-326通過靶向Th17細胞分化的負調(diào)控因子E26靶向因子-1(E26 transformation-specific-1，Ets-1)抑制Ets-1的合成，進而促進Th17細胞的分化，導致EAE病情加重。另外，miR-155也可以通過靶向抑制Ets-1促進Th17細胞的分化，加重EAE病情[15]。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)在EAE中miR-155的表達明顯上調(diào)并與疾病的嚴重性成正相關(guān)，EAE小鼠中miR-155過表達可導致Th1和Th17細胞比例升高，IL-17和IFN-γ產(chǎn)生增多，表明miR-155可能通過促進Th1和Th17細胞的分化加重EAE的病情；用miR-155抑制劑治療的小鼠EAE病程延遲、疾病嚴重程度降低并且中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的炎癥浸潤也減少，這提示miR-155可能是治療MS/EAE的一個有效治療靶點。

STAT3作為Th17細胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子對Th17的分化十分重要。miR-301a在MS的CD4+T細胞中過表達，并通過靶向活化的STAT3蛋白抑制物(protein inhibitor of activated STAT3，PIAS3)的mRNA抑制STAT3信號轉(zhuǎn)導，進而促進Th17細胞的分化[17]。let-7f-5p在MS患者的外周血CD4+T細胞和Th17細胞分化過程中表達明顯降低，與let-7f-5p表達降低相反，STAT3和磷酸化的STAT3蛋白水平顯著升高，且與let-7f-5p表達水平呈負相關(guān)；另外，研究還發(fā)現(xiàn)STAT3是let-7f-5p的直接靶點，let-7f-5p過表達可抑制Th17的分化，在MS中l(wèi)et-7f-5p通過表達下調(diào)促進Th17細胞的分化而參與MS的發(fā)展[18]。磷脂酰肌醇3-激酶-蘇氨酸激酶-哺乳動物雷帕霉素靶點(phosphatidyl inositol 3-kinase-protein kinase B-mammalian target of rapamycin，PI3K-AKT-mTOR)軸是監(jiān)管Th17分化的主要功能軸，能加強STAT3磷酸化，促進RORγt 轉(zhuǎn)錄。miR-17和miR-19b是miR-17-92基因簇負責促進Th17分化的兩個miRNA。miR-19b可抑制磷酸酶和張力蛋白同源性基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)的表達，促進PI3K-AKT-mTOR軸的激活，進而促進非致病性Th17細胞的分化。Ikaros家族鋅指4(Ikaros family zinc finger 4，IKZF4)能負向調(diào)控Th17細胞分化，而miR-17還可通過抑制IKZF4表達促進致病性Th17細胞的分化[19]。

Smad信號通路與Th17細胞分化密切相關(guān)。miR-181c在EAE小鼠CD4+T細胞中高表達，其表達與疾病的嚴重程度呈正相關(guān)。miR-181c與Smad7靶向結(jié)合，抑制Smad7表達，解除Smad7對TGF-β介導的Smad信號通路的抑制作用，進而增強Smad信號通路，激活對IL-2自分泌的抑制作用，促進Th17細胞的分化；敲低小鼠miR-181c的表達可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的炎性細胞浸潤和髓鞘脫失，減輕EAE癥狀和延緩疾病進展，這表明miR-181c通過促進Th17的分化參與EAE的發(fā)生發(fā)展[20]。此外，miR-21在EAE小鼠Th17細胞中的表達升高，也通過靶向Smad7抑制Smad7表達，進而促進Th17細胞的分化[21]。

miR-590也與Th17細胞分化密切相關(guān)，它首先在腫瘤領(lǐng)域中被發(fā)現(xiàn)。miR-590的靶向因子Tob1是tob/btg1抗增殖蛋白家族的成員，在腫瘤發(fā)展中起著至關(guān)重要的抑制作用。最近研究表明miR-590在MS患者Th17細胞中的表達明顯上調(diào)，并且其表達與Tob1呈負相關(guān)，還發(fā)現(xiàn)miR-590可直接作用于Tob1基因并抑制其表達來促進致病性Th17細胞分化，進而增強中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應，導致MS病情加重；另外，miR-590的過表達還可通過上調(diào)如CXCL3、CSF2和IL-23R等炎癥相關(guān)分子增加Th17細胞的致病性[22]。

3.2.2抑制Th17細胞分化：Zhu等[23]發(fā)現(xiàn)在EAE小鼠CD4+T細胞和Th17細胞中miR-20b的表達明顯下調(diào)，而在Th1、Th2、iTreg細胞則上調(diào)；該研究還發(fā)現(xiàn)ROR-γt和STAT3都是miR-20b的潛在靶點，用慢病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠使miR-20b過表達，可使ROR-γt和STAT3表達下降，進而抑制Th17細胞分化，減輕EAE癥狀，這表明miR-20b通過靶向抑制ROR-γt和STAT3表達，進而抑制Th17分化而緩解EAE進程。另外，有研究發(fā)現(xiàn)miR-30a靶向作用于IL-21受體也可抑制致病性Th17細胞的分化，減輕EAE的嚴重程度[24]；而miR-26a則通過靶向IL-6抑制Th17細胞功能并加強Treg細胞功能，進而減輕EAE病情[25]。

miR-146a現(xiàn)已被確認為減少炎癥基因表達的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，研究表明miR-146a通過靶向抑制腫瘤壞死因子受體相關(guān)分子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)和白細胞介素1受體相關(guān)激酶1(interleukin 1 receptor associated kinase 1，IRAK1)的表達，進而下調(diào)自身反應性CD4+T細胞中核因子κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)的活性，阻斷T細胞自分泌IL-6/IL-21-Th17分化途徑，抑制致病性Th17細胞的分化[26]。Liu等[27]研究發(fā)現(xiàn)miR-15b在EAE小鼠和MS患者的CD4+T細胞中表達明顯下調(diào)。通過動物實驗研究還發(fā)現(xiàn)，miR-15b通過靶向O連接N乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(O-linkedN-acetylglucosamine transferase，OGT)來抑制Th17細胞的分化，還通過降低NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族成員c-Rel和p65的O-GlcN?；?，抑制ROR-γt的轉(zhuǎn)錄激活，進而抑制Th17細胞的分化；miR-15b過表達可減輕EAE的癥狀，而敲除miR-15b可使EAE癥狀加重。

3.3 對Treg細胞的調(diào)控Treg也是CD4+T細胞的重要亞群，miRNA在調(diào)節(jié)Treg的活化、分化、抑制功能以及穩(wěn)定性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Dolati等[28]報道 miR-142-3P直接靶向作用于腺苷酸環(huán)化酶 9(adenylate cyclase 9，AC9)的 mRNA使細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)維持于低水平。高水平的cAMP可增強Treg細胞的抑制功能，miR-142-3P表達可被Foxp3抑制，導致cAMP生成增加進而增強Treg細胞的抑制功能。研究表明miR-146a在EAE小鼠的Treg中高表達，對Treg的抑制作用至關(guān)重要，miR-146a缺乏導致Treg細胞數(shù)量增加，但功能受損，從而導致大量淋巴細胞活化和組織浸潤，以及免疫耐受性的破壞，表現(xiàn)為多個器官中致命的IFN-γ依賴性免疫介導的損傷[29]。miR-155在EAE小鼠的Treg中表達明顯增加，miR-155敲除小鼠Treg數(shù)量減少，但Treg抑制功能不受影響；進一步研究證明miR-155通過靶向作用于SOCS1促進Treg的增殖和存活，從而提高細胞對其主要生長因子的敏感性，對Treg的發(fā)育和譜系穩(wěn)定性具有重要作用[30]。

有研究顯示，在miR-125a敲除鼠中，Treg的分化出現(xiàn)了明顯障礙，與對照組相比，miR-125a敲除型EAE小鼠表現(xiàn)出的癥狀明顯嚴重，而注射了miR-125a模擬物的EAE小鼠，其發(fā)病程度明顯減輕；這些表明miR-125a在調(diào)節(jié)Treg細胞譜系的分化和維持免疫穩(wěn)態(tài)方面起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[31]。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族成員c-Rel對胸腺細胞發(fā)育至關(guān)重要，對Treg的分化和體內(nèi)平衡也非常關(guān)鍵，在胸腺細胞發(fā)育過程中，miR-27的過表達通過抑制c-Rel極大地減少Treg的產(chǎn)生，其既損害了胸腺Treg的發(fā)育，也損害了外周Treg的穩(wěn)態(tài)[28]。

Smad7是轉(zhuǎn)化生長因子βⅠ型受體(TGF-βreceptortype Ⅰ，TGFβR Ⅰ)信號通路的負調(diào)控因子，它可以驅(qū)動Th1細胞介導的免疫應答而抑制Treg細胞。研究表明miR-181a和miR-181b在EAE和MS患者中的表達顯著降低，與miR-181相反，Smad7表達則升高；通過動物實驗還發(fā)現(xiàn)miR-181a和miR-181b可直接抑制Smad7表達而促進Treg細胞分化[32]。

綜上，近年來許多研究發(fā)現(xiàn)miRNA通過作用于某些特異性調(diào)節(jié)因子參與不同信號傳導途徑，調(diào)控CD4+T細胞亞群的分化和功能，進而影響MS/EAE的發(fā)病以及疾病嚴重性，這提示miRNA可能為MS的診斷和治療提供新幫助，但miRNA具有靶向多樣性，在這些調(diào)控過程中的具體作用機制尚未完全清楚，仍需進一步探討。