張春霞 徐貴生 時(shí)金艷

結(jié)核病作為全球十大死因之一，是重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題，其中耐多藥結(jié)核病嚴(yán)重威脅人類健康，成為我國(guó)結(jié)核病控制的難點(diǎn)和重點(diǎn)問(wèn)題[1]。世界衛(wèi)生組織2020年全球結(jié)核病報(bào)告顯示，2019年全球范圍內(nèi)估計(jì)有1000萬(wàn)例新發(fā)結(jié)核病患者，約3.3%(46.5萬(wàn)例)的初治患者和18%的復(fù)治患者對(duì)利福平耐藥，其中耐多藥結(jié)核病患者約占78%，為36.3萬(wàn)例[2]。耐多藥結(jié)核病患者治療時(shí)間長(zhǎng)達(dá)2年，治療藥品由多種二線抗結(jié)核藥品組成，這些藥品對(duì)患者的不良反應(yīng)大，對(duì)耐多藥結(jié)核病患者的治療成功率僅為54.0%[3-4]。耐多藥結(jié)核病的診斷對(duì)其防治具有重要意義，筆者對(duì)耐多藥結(jié)核病的診斷方法進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為耐多藥結(jié)核病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

耐多藥結(jié)核病的診斷方法

耐多藥結(jié)核病是指結(jié)核病患者感染的結(jié)核分枝桿菌經(jīng)體外藥物敏感性試驗(yàn)證實(shí)至少同時(shí)對(duì)異煙肼和利福平耐藥[5]。耐多藥結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制大致可分為3種類型：(1)降低細(xì)胞膜的通透性和外排泵機(jī)制；(2)產(chǎn)生降解或滅活酶類；(3)改變抗結(jié)核藥品作用的靶位[6]。目前，耐多藥結(jié)核病的診斷方法主要包括以下幾種。

一、傳統(tǒng)培養(yǎng)基培養(yǎng)方法

耐多藥結(jié)核病的成功診斷和治療基于藥物敏感性試驗(yàn)的結(jié)果。藥物敏感性試驗(yàn)包括通過(guò)培養(yǎng)基培養(yǎng)觀察結(jié)核分枝桿菌對(duì)抗結(jié)核藥品的敏感性和檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌相關(guān)耐藥基因的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)[7]。傳統(tǒng)表型藥物敏感性試驗(yàn)包括絕對(duì)濃度法、比例法、抗性比率法；其中最為常用的是比例法；由于實(shí)驗(yàn)技術(shù)的成熟，絕對(duì)濃度法使用也較為廣泛，這些方法敏感度高，臨床相關(guān)性好[8-9]。固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法包括世界衛(wèi)生組織推薦使用的以瓊脂為基質(zhì)的MiddleBrook 7H10/7H11等方法。由于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)所需的時(shí)間較長(zhǎng)，獲得藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果需要2～3個(gè)月的時(shí)間[10]，液體培養(yǎng)基能夠克服其不足，液體培養(yǎng)基的方法即讓結(jié)核分枝桿菌在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中往往添加促生長(zhǎng)因子，能夠?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)提供充足營(yíng)養(yǎng)，液體培養(yǎng)基中還加入能夠抑制多種雜菌生長(zhǎng)的抗生素。液體培養(yǎng)基主要有手工培養(yǎng)法和自動(dòng)培養(yǎng)法。手工培養(yǎng)法有MiddleBrook 7H9和Sauton培養(yǎng)基，自動(dòng)培養(yǎng)法有BACTEC 460、BACTEC MGIT 960、BacT/ALERT3D系統(tǒng)、VersaTrek分枝桿菌液體培養(yǎng)系統(tǒng)，該種類型的培養(yǎng)基能夠提高結(jié)核分枝桿菌分離陽(yáng)性率，減少培養(yǎng)所需時(shí)間[11]。其中在液體培養(yǎng)基體系中，最常用的培養(yǎng)基是BACTEC MGIT 960，該培養(yǎng)基的原理是通過(guò)檢測(cè)二氧化碳的產(chǎn)生和結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)指示管氧氣的消耗量來(lái)進(jìn)行耐藥性的檢測(cè)[12]。

二、分子藥物敏感性試驗(yàn)技術(shù)

分子藥物敏感性試驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展克服了傳統(tǒng)表型藥物敏感性試驗(yàn)所需時(shí)間較長(zhǎng)的缺點(diǎn)。這些檢測(cè)技術(shù)可以通過(guò)擴(kuò)增核酸來(lái)診斷耐多藥結(jié)核病，通過(guò)識(shí)別特定基因的堿基突變來(lái)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的耐藥性[13]。這些基因型檢測(cè)比表型藥物敏感性試驗(yàn)更快速和準(zhǔn)確。分子藥物敏感性試驗(yàn)大致可分為：基于探針的檢測(cè)技術(shù)、基于基因測(cè)序技術(shù)的檢測(cè)方法和其他分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。

(一)基于探針的藥物敏感性試驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)

基于探針的藥物敏感性試驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)包括線性探針檢測(cè)(line probe assays)和GeneXpert MTB/RIF。2008年，世界衛(wèi)生組織批準(zhǔn)了使用線性探針技術(shù)用于結(jié)核病和耐藥結(jié)核病的診斷[14]。2016年，世界衛(wèi)生組織推薦在培養(yǎng)陽(yáng)性或痰涂片陽(yáng)性標(biāo)本患者中使用線性探針檢測(cè)和MTBDRplus技術(shù)，用于耐藥結(jié)核病以及異煙肼、利福平耐藥性的檢測(cè)[15-16]。MTBDRplus技術(shù)是一種半自動(dòng)化的基因型檢測(cè)方法，包括DNA提取、多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增和反向雜交3個(gè)步驟。該方法可以檢測(cè)利福平rpoB耐藥基因及異煙肼katG耐藥基因和inhA啟動(dòng)子區(qū)域的突變[17]。Siddiqui等[18]的研究顯示，MTBDRplus對(duì)利福平檢測(cè)的敏感度為98.8%，對(duì)異煙肼檢測(cè)的敏感度為90.6%。2018年，世界衛(wèi)生組織推薦將GenoType MTBDRsl用于耐多藥結(jié)核病的診斷，其可以檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的乙胺丁醇耐藥基因embB突變、氟喹諾酮類藥品的gyrA和gyrB耐藥基因突變和注射類藥品(卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素)的rrs耐藥基因突變[5,19]。2020年，世界衛(wèi)生組織建議使用GeneXpert MTB/RIF作為成人和兒童肺部和肺外結(jié)核耐藥性的初步診斷方法，如對(duì)結(jié)核性腦膜炎和淋巴結(jié)結(jié)核的診斷[16]。GeneXpert MTB/RIF是一種基于實(shí)時(shí)PCR的全自動(dòng)分子檢測(cè)方法，用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平的耐藥性。該檢測(cè)方法可在2 h內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果。Yasemin等[20]的研究顯示，GeneXpert MTB/RIF的敏感度和特異度分別為92.4%和97.1%。相較于GeneXpert MTB/RIF，GeneXpert MTB/RIF Ultra對(duì)于結(jié)核分枝桿菌較少的標(biāo)本，尤其是涂片陰性、培養(yǎng)陽(yáng)性的標(biāo)本(主要來(lái)源于并發(fā)HIV感染的人群)、兒科標(biāo)本和肺外結(jié)核標(biāo)本(特別是腦脊液標(biāo)本)，檢測(cè)的敏感度增加。Shao等[21]采用GeneXpert MTB/RIF Ultra 對(duì)結(jié)核性腦膜炎患者的耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，敏感度和特異度分別為93%和100%。但GeneXpert MTB/RIF Ultra診斷的準(zhǔn)確性還需要更多的研究加以佐證。

(二)其他分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

該類檢測(cè)技術(shù)有聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)，大多數(shù)情況下細(xì)菌的DNA片段中單一的堿基置換就足以引起單鏈DNA空間構(gòu)象發(fā)生改變。發(fā)生的改變能夠?qū)е略搯捂淒NA電泳遷移率發(fā)生改變。PCR-SSCP的原理正是用電泳的方法將含有突變的DNA片段與正常的DNA片段比較后進(jìn)行區(qū)分。Ali等[22]通過(guò)PCR-SSCP檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因(katG、rpoB)的突變，對(duì)了解結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼、利福平的耐藥狀況具有重要意義。Choi等[23]的研究顯示，異煙肼、利福平和環(huán)丙沙星的耐藥性與katG、rpoB和gyrA基因突變有關(guān)，通過(guò)PCR-SSCP檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的katG、rpoB和gyrA耐藥基因，并且分析臨床耐藥情況，對(duì)指導(dǎo)結(jié)核病的治療具有重要意義。PCR-SSCP技術(shù)操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)所需時(shí)間較短，對(duì)于設(shè)備和試劑無(wú)特殊要求，無(wú)放射性污染，技術(shù)條件成熟，檢出率相對(duì)較高，使用廣泛，但也會(huì)受到待測(cè)DNA片段長(zhǎng)度、聚丙烯酰胺的濃度、緩沖液的離子強(qiáng)度及電泳時(shí)的溫度等因素的影響，限制了該方法的實(shí)際應(yīng)用，并且PCR-SSCP無(wú)法給出突變位點(diǎn)的具體位置和突變性質(zhì)，故只能用于基因突變的篩選[24-25]。

(三)基因測(cè)序技術(shù)

1.DNA直接測(cè)序法：細(xì)菌基因組DNA直接測(cè)序法利用PCR擴(kuò)增需要測(cè)量的基因序列，將DNA片段直接進(jìn)行測(cè)序，用測(cè)得的堿基序列與標(biāo)準(zhǔn)株的同一段DNA片段進(jìn)行比較，尋找堿基突變的位置和突變類型，目前DNA直接測(cè)序法是檢測(cè)細(xì)菌基因突變所使用的標(biāo)準(zhǔn)[26-27]。Cole等[28]于1998年首次對(duì)結(jié)核分枝桿菌的基因序列進(jìn)行了全基因組測(cè)序(whole genome sequencing，WGS)，得到了結(jié)核分枝桿菌全基因組的堿基組成數(shù)量及其所包含的基因數(shù)量，并且發(fā)現(xiàn)了結(jié)核分枝桿菌的遺傳物質(zhì)與其他細(xì)菌的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)了可能導(dǎo)致其發(fā)生抗原變異的遺傳物質(zhì)機(jī)理。Roa等[29]通過(guò)對(duì)臨床與實(shí)驗(yàn)室分離的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行WGS，并與H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了基因中很多與異煙肼、利福平、鏈霉素等抗結(jié)核藥品相關(guān)的堿基突變。

2.二代基因測(cè)序法：二代基因測(cè)序法(next generation gene sequencing，NGS)又稱高通量測(cè)序(high through put sequencing)，是世界衛(wèi)生組織推薦的用于快速診斷結(jié)核病的方法，能夠在減少患者耐藥治療延誤的基礎(chǔ)上診斷耐藥結(jié)核病。目前的WGS不能完全區(qū)分低耐藥性和高耐藥性的突變，或者與耐藥性無(wú)關(guān)的一些突變[30-31]。由于在臨床分離株中進(jìn)行WGS存在需要做結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)以產(chǎn)生足夠菌量的缺點(diǎn)，相比之下，靶向NGS可以直接對(duì)臨床分離株樣本進(jìn)行測(cè)序，該方法可快速運(yùn)用患者痰液標(biāo)本進(jìn)行耐多藥檢測(cè)[32-33]。因此，NGS可以為所有臨床相關(guān)耐藥突變提供深入而全面的數(shù)據(jù)，可替代目前診斷耐多藥結(jié)核病的表型診斷方法和分子藥物敏感性試驗(yàn)診斷方法。

NGS目前有3種類型。分別是Illumina、Roche 454和ABI-SoliD reprint[34-36]。目前已有許多關(guān)于使用NGS對(duì)結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)進(jìn)行研究的報(bào)道。Ko等[37]將NGS應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌耐藥基因分析，得到耐藥基因堿基突變情況列表，為今后使用NGS進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變位點(diǎn)的研究提供了參考。Coll等[26]通過(guò)對(duì)中國(guó)、巴基斯坦、馬拉維等國(guó)的792株結(jié)核分枝桿菌基因組表型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，編制了一個(gè)能預(yù)測(cè)15種抗結(jié)核藥品耐藥性且包括1325個(gè)突變的數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)其中包括異煙肼、利福平、鏈霉素在內(nèi)的11種抗結(jié)核藥品的耐藥性進(jìn)行了驗(yàn)證，建立了一種快速在線“TB-Profiler”分析器，能夠直接從原始序列報(bào)告結(jié)核病耐藥性和基因突變類型的分布圖。NGS由于具有通量大、檢測(cè)時(shí)間短、精確度高、信息量豐富等優(yōu)點(diǎn)，被臨床廣泛應(yīng)用于耐藥結(jié)核病，特別是耐多藥結(jié)核病的檢測(cè)。

總 結(jié)

作為全球重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題，耐多藥結(jié)核病的防治對(duì)于結(jié)核病的防治具有重要意義。因此，對(duì)于耐多藥結(jié)核病的檢測(cè)顯得尤為重要。對(duì)于結(jié)核病患者，如診斷后不進(jìn)行耐藥檢測(cè)就盲目使用抗結(jié)核藥品，容易使患者產(chǎn)生耐藥和導(dǎo)致治療失敗。分子藥物敏感性試驗(yàn)技術(shù)應(yīng)用于耐藥結(jié)核病的診斷已得到快速發(fā)展。NGS用于耐藥結(jié)核病的診斷時(shí)能夠直接從臨床樣本中提取DNA進(jìn)行檢測(cè)，可減少指導(dǎo)臨床用藥時(shí)間，并能夠?qū)甑亩玖εc進(jìn)化譜系進(jìn)行分析，對(duì)研究耐多藥結(jié)核病的致病機(jī)制和傳播機(jī)制具有重要意義，同時(shí)使患者能夠盡早接受耐藥治療，降低疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)結(jié)核病的防治具有重要意義。