王希江 譚云洪 賀文從 歐喜超 劉東鑫 趙雁林

耐藥結(jié)核病的廣泛流行是結(jié)核病有效防控的巨大挑戰(zhàn)。WHO[1]報(bào)告顯示，2019年全球約50萬(wàn)例利福平耐藥(rifampicin resistance tuberculosis, RR-TB)新發(fā)結(jié)核病患者，其中78%為耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistance tuberculosis，MDR-TB)患者。據(jù)估計(jì)，在這部分患者中，僅51%的患者被檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，30%的患者獲得治療，治療成功率為56%[1]，這在很大程度上導(dǎo)致了RR/MDR-TB的傳播和流行。目前，結(jié)核病的防控主要依賴(lài)于快速診斷和有效治療，尤其是對(duì)耐藥性的及時(shí)正確診斷是確定有效治療方案、提高治愈率，進(jìn)而阻斷傳播的基礎(chǔ)。表型藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)“藥敏試驗(yàn)”)價(jià)格昂貴、耗時(shí)較長(zhǎng)，且對(duì)設(shè)備要求較高。目前包括GeneXpert?(Cepheid, USA)、GenoType MTBDR plus V2 (Hain Life science GmbH, Nehren, DE)及AID TB Resistance Line Probe Assay (AID GmbH, Strassberg, DE)等的一系列分子生物學(xué)檢測(cè)方法，雖然可以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，但僅針對(duì)某些特定的耐藥基因，無(wú)法識(shí)別全部的耐藥突變位點(diǎn)。全基因組測(cè)序(whole genome sequencing, WGS)基于整個(gè)4.4 Mb 結(jié)核分枝桿菌基因組進(jìn)行檢測(cè)，在提供全面的耐藥突變位點(diǎn)同時(shí)，還可識(shí)別異質(zhì)性耐藥，很大程度上彌補(bǔ)了靶向分子方法的缺陷。

利福平(RFP)和異煙肼(INH)作為治療結(jié)核病的基石，其耐藥突變位點(diǎn)多樣性已有報(bào)道[2-3]，進(jìn)一步研究表明不同的突變位點(diǎn)及突變方向可能導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)不同，而不同的MIC值可能會(huì)引起治療效果的差異。因此，本研究以新疆維吾爾自治區(qū)(簡(jiǎn)稱(chēng)“新疆”)和湖南省國(guó)家耐藥監(jiān)測(cè)點(diǎn)的菌株為例，采用WGS全面了解RFP及INH耐藥菌株分子特征的同時(shí)，將反映耐藥水平高低的MIC值與耐藥突變位點(diǎn)相結(jié)合，探究耐藥突變基因型與耐藥水平的量化關(guān)系，以期為我國(guó)相關(guān)分子生物學(xué)診斷方法的研發(fā)和臨床用藥方案及劑量的確定提供依據(jù)。

資料和方法

一、 菌株來(lái)源

2016—2017年新疆(柯坪縣、岳普湖縣和疏勒縣)和湖南(懷化市、永順縣、祁東縣、桃江縣和耒陽(yáng)市)國(guó)家耐藥監(jiān)測(cè)點(diǎn)的所有痰涂片陽(yáng)性肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)，獲得陽(yáng)性培養(yǎng)物。最終獲得785株結(jié)核分枝桿菌，新疆193株，湖南592株。

二、 實(shí)驗(yàn)方法

(一)菌株培養(yǎng)

將含有菌液的凍存管放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中復(fù)蘇。吸取0.1～0.15 ml菌液均勻接種于培養(yǎng)管的羅氏培養(yǎng)基上，每株菌接種2支培養(yǎng)管。將培養(yǎng)管放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。具體操作參考《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[4]。培養(yǎng)基購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

(二)藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)采用TREK Sensititre?MYCOTBI藥敏板(美國(guó) Thermo公司)，測(cè)定結(jié)核分枝桿菌對(duì)RFP和INH兩種抗結(jié)核藥物的MIC[5-7]。利福平和異煙肼均按倍比含量以?xún)龈煞鄣男问焦讨谖⒖装迳希幬餄舛确謩e為0.12～16 μg/ml和0.03～4 μg/ml。操作過(guò)程按照生產(chǎn)企業(yè)操作手冊(cè)進(jìn)行。采用超聲磨菌儀(體必康生物科技有限公司)制備0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，?00 μl制備好的菌懸液加至10 ml的Middlebrook 7H9肉湯培養(yǎng)基(OADC生長(zhǎng)添加劑濃度為10%)中，混勻后，通過(guò)SensititreTM接種儀(Thermo Fisher, Scientific Inc., USA)接種，每孔100 μl。接種完成后，用黏性貼膜將藥敏板密封，置于37 ℃含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，由VizionTM數(shù)字觀察系統(tǒng)輔助讀板。MIC定義為與陽(yáng)性對(duì)照孔相比較沒(méi)有明顯可見(jiàn)的細(xì)菌菌落生長(zhǎng)的最低濃度。

藥敏試驗(yàn)均采用結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv (ATCC 27294)作為藥物敏感菌株對(duì)照。每塊藥敏板含有兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔(不含抗結(jié)核藥物)，如果兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔中均存在可見(jiàn)的或可接受的細(xì)菌生長(zhǎng)，且該藥對(duì)應(yīng)的孔中沒(méi)有污染、蒸發(fā)和跳孔現(xiàn)象時(shí)，則MIC結(jié)果認(rèn)為是可讀且有效的。由2名實(shí)驗(yàn)員分別通過(guò)VizionTM數(shù)字觀察系統(tǒng)讀取結(jié)果，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行復(fù)核，不一致的結(jié)果進(jìn)行重新讀取。

臨界值濃度參考CLSI MA-24，INH臨界濃度為0.2 μg/ml，RFP臨界濃度為1 μg/ml,菌株的MIC值>臨界值，則結(jié)核分枝桿菌對(duì)該藥耐藥，如果MIC值≤臨界值，則為敏感。788株結(jié)核分枝桿菌，3株因藥敏試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效而被排除，最終785株結(jié)核分枝桿菌獲得有效的藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

(三)全基因組測(cè)序及耐藥預(yù)測(cè)

785株結(jié)核分枝桿菌經(jīng)藥敏試驗(yàn)判定為RFP和(或)INH耐藥124株，對(duì)124株菌采用CTAB/NaCl法提取其全基因組。利用Nanodrop ND-1000核酸分析儀測(cè)定核酸樣本的濃度及純度，保證樣本滿足光密度260/280=1.8～2.0，光密度260/230=2.0～2.2，濃度>50 ng/μl。合格樣本由中國(guó)科學(xué)院微生物所利用Illumina公司的NextSeq500測(cè)序儀，使用2×150 bp雙端測(cè)序?qū)Y(jié)核分枝桿菌DNA完成測(cè)序。

(四)生物信息學(xué)分析

124株結(jié)核分枝桿菌完成測(cè)序后使用Trim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore)及FastQC對(duì)原始FASTQ序列進(jìn)行過(guò)濾。選取Reads平均深度超過(guò)60 ×(“×”指測(cè)序深度)，覆蓋度超過(guò)97%的樣本用于后續(xù)分析。將質(zhì)控合格的FASTQ測(cè)序文件上傳到TB Profiler (Version 2.7.4)進(jìn)行基因型耐藥分析[8]。

(五)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Excel 2016建立原始數(shù)據(jù)庫(kù)，采用統(tǒng)計(jì)描述對(duì)耐藥菌株的分子特征進(jìn)行對(duì)比分析。

結(jié) 果

一、 表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果

124株檢測(cè)為RFP和(或)INH耐藥，包括RFP單耐藥菌株13株，INH單耐藥菌株50株，對(duì)兩者同時(shí)耐藥(MDR-TB)61株，耐多藥率為7.77%(61/785)。

二、 耐藥相關(guān)基因突變分布

122株RFP和INH耐藥菌株獲得全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)(2株因建庫(kù)失敗或者質(zhì)控不合格而被排除)，并納入最終分析，包括59株MDR菌株，50株單耐INH菌株，13株單耐RFP菌株。

1. 利福平耐藥相關(guān)基因突變分布：72株RFP耐藥菌株中， 70株(97.22%)檢測(cè)出rpoB基因耐藥相關(guān)位點(diǎn)突變，其中98.57%(69/70)的突變出現(xiàn)在利福平耐藥決定區(qū)(RRDR)。WGS分析共檢測(cè)到23種錯(cuò)義突變形式，除一種突變形式(rpoBLeu430Pro)對(duì)應(yīng)的表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果為敏感外，其他均表現(xiàn)為耐藥(表1)。RFP耐藥菌株的相關(guān)基因突變主要位于rpoB450、rpoB445以及rpoB435密碼子，占81.43%(57/70)，其中rpoBSer450Leu為最常見(jiàn)的突變(45.71%，32/70)，其次是rpoB445密碼子的多種錯(cuò)義突變(28.57%, 20/70)，主要包括His445Tyr(9株)、His445Leu(5株)和His445Asp(4株)。2.86%(2/70)的耐藥菌株同時(shí)存在rpoC補(bǔ)償性突變(表1)。耐藥突變以單密碼子突變?yōu)橹?78.57%，55/70)，組合突變(指一株菌中出現(xiàn)多個(gè)耐藥位點(diǎn))出現(xiàn)的頻率為21.43%(15/70)，其中以rpoB(His445Tyr+Asp435Phe)組合最為常見(jiàn)(5/15)(表1)。

2. 異煙肼耐藥相關(guān)基因突變分布：109株INH耐藥菌株中，102株(93.58%)存在耐藥相關(guān)基因突變，7株(6.42%)未檢測(cè)到耐藥相關(guān)位點(diǎn)突變(表2)。TB profiler分析結(jié)果顯示，共檢測(cè)到18種耐藥突變形式，突變涉及katG、ahpC、inhA、fabG1基因及其上游調(diào)控區(qū)域，其中以katG(81.37%，83/102)基因突變?yōu)橹鳌?5.29%(87/102)的INH耐藥突變位于katG315密碼子以及fabG1啟動(dòng)子區(qū)，其中katGSer315Thr為最常見(jiàn)的耐藥突變(57.84%,59/102)，包括57株單基因突變和2株組合突變菌株。有8株(7.34%，8/109)INH耐藥菌株在katG基因的非315密碼子區(qū)發(fā)生突變。fabG1-inhA啟動(dòng)子區(qū)C-15T的核苷酸改變是INH耐藥相關(guān)的第二大突變(16.67%,17/102)，inhA基因編碼區(qū)突變頻率僅為0.91%(1/109)(表2)。INH耐藥突變以單基因突變?yōu)橹?87.25%，89/102)，組合突變僅占11.93%(13/109)。

表1 利福平耐藥相關(guān)基因突變分布情況

三、 耐藥基因突變與MIC分布

比較122株RFP和INH耐藥菌株的耐藥基因突變與MIC的分布情況(圖1)，不同的耐藥基因突變導(dǎo)致的耐藥水平的高低不同。對(duì)于RFP，rpoBS450X、rpoBH445Y、rpoBH445D、rpoBD435V及rpoBS441L突變導(dǎo)致的耐藥為高水平耐藥(MIC均≥16 μg/ml)，ropBH445L突變導(dǎo)致的耐藥水平對(duì)應(yīng)的MIC值在2～8 μg/ml之間浮動(dòng)，rpoBL452P突變導(dǎo)致的耐藥水平較低 (2 μg/ml)。大多數(shù) (93.33%，14/15)組合突變(指一株菌出現(xiàn)多個(gè)耐藥突變位點(diǎn))導(dǎo)致的耐藥為高水平耐藥,而rpoBL430P突變菌株的MIC值僅為0.25 μg/ml,表型藥敏結(jié)果為敏感株，2株野生型菌株(wild-type，wt)的MIC值>16 μg/ml，表現(xiàn)為高水平耐藥。對(duì)于INH、katGS315T、katGS315N及ahpC(C-81T)突變引起的耐藥水平較高(MIC≥2 μg/ml)，ahpC(G-48A)引起的耐藥水平高低不等，MIC值跨度范圍較大(0.5～4 μg/ml)。而fabG1(C-15T)突變導(dǎo)致的耐藥水平較低，多在臨界值鄰近位置波動(dòng) (0.2 μg/ml)。多位點(diǎn)組合基因突變以及其他突變引起的耐藥水平高低不等。7株野生型菌株為表型耐藥菌株，其耐藥水平差異較大(圖1)。

討 論

結(jié)核分枝桿菌耐藥的主要機(jī)制是DNA突變[9]，使得通過(guò)檢測(cè)基因突變?cè)\斷耐藥性成為可能。WGS基于結(jié)核分枝桿菌全基因組(4.4 Mb)的檢測(cè)分析提供了關(guān)于多態(tài)性、插入和缺失(indels)的準(zhǔn)確信息，彌補(bǔ)了靶向分子檢測(cè)手段的缺陷，已成為預(yù)測(cè)耐藥性的有力診斷工具[10]。本研究通過(guò)采用WGS對(duì)RFP和(或)INH耐藥菌株的分子特征進(jìn)行全面闡述，并將耐藥基因突變與MIC相結(jié)合進(jìn)行分析，以明確耐藥突變與耐藥水平的關(guān)系，進(jìn)一步豐富和完善了對(duì)RFP和INH基因型是否為耐藥基因型的解釋。

表2 異煙肼相關(guān)耐藥基因突變分布情況

MIC是指小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度，如果在藥物最高濃度的孔內(nèi)仍有細(xì)菌生長(zhǎng)則判讀為>最高濃度，微孔板內(nèi)利福平最高濃度為16 μg/m，異煙肼最高濃度為4 μg/ml。 不同顏色表示不同耐藥位點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)代表一株菌株，虛線表示臨界濃度值(RFP 1 μg/ml, INH 0.2 μg/ml)，為避免點(diǎn)過(guò)度重合，點(diǎn)可能在測(cè)定MIC值的上下小范圍浮動(dòng)。rpoB (S450X)包括:rpoB(S450L)(31株)， rpoB(S450F) (1株)，rpoB(S450W)(1株)；組合突變表示一株菌中含2種及以上的突變；RFP中其他包括rpoB (I491F)(1株)，rpoB (S441L) (2株), rpoB (L430P)(1株)，rpoB(D435Y)(3株); INH中其他包括katG (146_147insTGCA)(1株)，katG (V1A)(1株)，ahpC(C-54T)(1株)，ahpC(C-52T)(1株)，katG (A109V)(1株), ahpC(C-81T)(2株);野生型表示不存在耐藥基因突變(耐異煙肼菌株7株)

本研究結(jié)果顯示，WGS對(duì)RFP耐藥菌株的檢出率為97.22%，與Kardan-Yamchi等[11]的研究結(jié)果基本一致，其中2株RFP耐藥菌株(MIC>16 μg/ml)未檢測(cè)到耐藥相關(guān)基因突變，重復(fù)藥敏試驗(yàn)證實(shí)表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果可靠，提示可能存在如細(xì)胞壁通透性降低、藥物外排泵改變等其他耐藥機(jī)制[12]。大量研究表明，超過(guò)95%的RFP耐藥菌株的耐藥突變發(fā)生于rpoB基因長(zhǎng)度為81bp的熱點(diǎn)區(qū)域(編碼密碼子426～452位)，即利福平耐藥決定區(qū)(RRDR)[13]。本研究檢測(cè)到一種發(fā)生在RRDR區(qū)以外的與RFP耐藥相關(guān)的罕見(jiàn)突變r(jià)poBI491F[14]，此發(fā)現(xiàn)提示，僅以檢測(cè)rpoB基因RRDR區(qū)的突變位點(diǎn)作為RFP耐藥篩查會(huì)導(dǎo)致該類(lèi)耐藥患者的漏診，進(jìn)而可能引起攜帶罕見(jiàn)突變的菌株在該地區(qū)的擴(kuò)散和流行。與以往研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)RFP耐藥相關(guān)位點(diǎn)突變主要出現(xiàn)在rpoBRRDR區(qū)的450、445及435密碼子[15-16]，且最常見(jiàn)的突變類(lèi)型為S450L(45.71%)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)rpoB450密碼子突變、rpoBH445Y、rpoBH445D突變與RFP高水平耐藥相關(guān)，而rpoBL452P突變?yōu)榈退侥退?，該結(jié)果與Jamieson等[16]研究結(jié)果吻合。值得注意的是，本研究結(jié)果顯示當(dāng)rpoBL452P突變菌株伴有rpoC補(bǔ)償性突變(rpoCI885V)時(shí)，其耐藥水平明顯升高(MIC>16 μg/ml)，提示補(bǔ)償性突變可能與耐藥水平的積累效應(yīng)有關(guān)，但由于本研究代償性突變菌株量較少，相關(guān)結(jié)論需要進(jìn)一步增加菌株量證明。目前，rpoBL430P突變與RFP耐藥相關(guān)已有報(bào)道[12,17]，但WHO仍將rpoBL430P列為可信度較低的RFP耐藥突變，且與低水平耐藥相關(guān)[18]，本研究中WGS檢測(cè)出的rpoBLeu430Pro突變菌株為表型敏感菌株(重復(fù)藥敏試驗(yàn)證實(shí)藥敏結(jié)果準(zhǔn)確)，得出的結(jié)論與WHO的結(jié)論相似，不建議將rpoBL430P突變列為RFP耐藥相關(guān)突變。

與RFP耐藥機(jī)制相比，INH的耐藥突變更為復(fù)雜，涉及多個(gè)基因[19]。在全球范圍內(nèi)，INH耐藥主要與katG和inhA啟動(dòng)子的突變有關(guān)，尤其是katG中的密碼子315和inhA啟動(dòng)子中的-15[20]，本研究?jī)烧呓M合后INH耐藥菌株的檢出率為85.29%。INH耐藥菌株中，katG315突變的發(fā)生率存在明顯的地理差異[3]，其頻率從42%至90%不等[21]， Zhang等[22]針對(duì)華東5省的137株耐INH菌株的研究結(jié)果顯示，katG315突變發(fā)生率為64.4%，而本研究katG315的突變率為81.37%，提示不同區(qū)域katG315突變可能存在差異，但是由于本研究樣本量及區(qū)域代表性均不足，要證明katG315突變區(qū)域性差異需要進(jìn)一步增加樣本量及采樣點(diǎn)。有研究表明，INH耐藥菌株在katG中發(fā)現(xiàn)315密碼子以外區(qū)域的突變頻率低于1%[3]，但本研究中突變頻率為7.34%，提示我國(guó)katG基因突變的多樣性較高。本研究發(fā)現(xiàn)katG密碼子315的突變表現(xiàn)為INH高水平耐藥，而fabG1C15T突變表現(xiàn)為低水平耐藥(MIC≤1 μg/ml)，與來(lái)自烏干達(dá)的研究報(bào)道一致[23]，但多重組合突變無(wú)明顯耐藥累積效應(yīng)。另有研究證明，高劑量INH (16～18 mg·kg-1·d-1)可以顯著縮短MDR-TB患者痰培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰時(shí)間及改善預(yù)后[24]，由此提示以基因型耐藥量化耐藥水平可以為INH劑量的選擇或藥物的更換提供理論依據(jù)。

研究表明細(xì)菌MIC值的高低與疾病治療效果及復(fù)發(fā)有著密切關(guān)系，部分MIC較低的耐藥菌株采用高濃度異煙肼和利福平治療可以達(dá)到較好的治療效果，而高濃度耐藥可能達(dá)不到預(yù)期的治療效果[25]，同樣敏感菌株中MIC值較高的細(xì)菌容易導(dǎo)致患者復(fù)發(fā)[26]，而目前以PCR為基礎(chǔ)的快速分子診斷技術(shù)僅能診斷細(xì)菌耐藥與否，不能明確給出突變位點(diǎn)位置及突變方向，本研究提示不同的耐藥位點(diǎn)與MIC值存在一定的關(guān)聯(lián)性，可以為后續(xù)更為精確的快速耐藥分子生物學(xué)診斷技術(shù)的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

本研究的局限性是未將納入的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行分析，可能潛在的成簇菌株會(huì)影響MIC值及耐藥基因的分布。盡管如此，本研究對(duì)了解我國(guó)部分地區(qū)RFP和INH耐藥基因突變譜有較大貢獻(xiàn)，同時(shí)提供了關(guān)于結(jié)核分枝桿菌耐藥基因型和MIC相關(guān)的數(shù)據(jù)，為闡明基因型耐藥與表型耐藥的量化關(guān)系提供了線索，有利于新型診斷技術(shù)的開(kāi)發(fā)和臨床決策的指導(dǎo)。