段惠娟 褚洪遷 孔成成 戴廣明 曹廷明 孫照剛

結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD)試驗(yàn)廣泛用于結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查、卡介苗(BCG)接種檢測(cè)、結(jié)核病篩查，以及結(jié)核病臨床診斷等方面。但由于PPD是多種抗原的混合物，其結(jié)果受到BCG接種及其他分枝桿菌感染的影響，診斷特異度低[1]。因此，在BCG普遍接種的地區(qū)，PPD試驗(yàn)用于結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染檢測(cè)受到了較大限制。近年來(lái)，利用結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)中不同細(xì)菌[如MTB、牛分枝桿菌或BCG基因組中存在的缺失片段(RD區(qū))]的特異性，為開(kāi)發(fā)新的高特異性診斷試劑提供了研究方向[2]。目前，重組結(jié)核桿菌融合蛋白(EC)[結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)重組融合蛋白]已作為新型MTB感染皮膚試驗(yàn)的檢測(cè)試劑通過(guò)了國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審批而準(zhǔn)予上市[3]，能有效區(qū)分MTB感染和BCG接種。除此之外，對(duì)MPT64、Rv1985c、Rv0222、Rv3117及Rv3120等相關(guān)蛋白的研究表明，它們?cè)诮Y(jié)核病血清學(xué)診斷方面具有一定的潛力[4-7]，但用于MTB感染皮膚試驗(yàn)鮮有報(bào)道。本研究篩選并表達(dá)了來(lái)自RD1、RD2、RD4、RD5、RD7、RD9、RD11區(qū)及MTB休眠相關(guān)抗原的12種重組抗原，以了解這些抗原用于MTB感染皮膚試驗(yàn)的診斷效果。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)菌株

MTB標(biāo)準(zhǔn)株(H37Rv，ATCC27294)由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院北京結(jié)核病臨床數(shù)據(jù)和樣本資源庫(kù)提供，接種在中性改良羅氏培養(yǎng)基上放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4周。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)豚鼠，雌性，體質(zhì)量250～300 g，共18只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011。

三、皮膚試驗(yàn)抗原

1.標(biāo)準(zhǔn)品：50 IU TB-PPD(產(chǎn)品批號(hào)：20190510)購(gòu)自北京祥瑞生物制品有限公司。

2.MTB特異性抗原：(1)篩選蛋白標(biāo)準(zhǔn)：①RD區(qū)抗原：在BCG中缺失，均能引起T細(xì)胞反應(yīng)；②MTB 休眠相關(guān)抗原：與結(jié)核分枝桿菌潛伏感染(LTBI)有關(guān)。(2)抗原：共表達(dá)12種抗原(表1)；(3)蛋白的表達(dá)純化：①根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中MTB中各抗原的基因序列設(shè)計(jì)合成引物；②PCR擴(kuò)增；③構(gòu)建重組質(zhì)粒及轉(zhuǎn)化至大腸桿菌；④進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化，其中，包涵體形式的蛋白在表達(dá)后，將超聲破碎后的菌液離心去上清，沉淀用適當(dāng)體積的8 mol/L尿素充分溶解，再離心取上清，再將其稀釋為 20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，4 mol/L尿素，pH 8.0 體系。再次離心，取上清，進(jìn)行純化，純化后電泳。

四、MTB特異性抗原皮膚試驗(yàn)濃度

1.EC抗原：稀釋終濃度至5 μg/ml。

2.其他抗原：將各抗原濃度分別用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至終濃度為50 μg/ml、5 μg/ml、1 μg/ml。本研究抗原濃度均根據(jù)EC濃度注射，EC皮膚試驗(yàn)注射量為每0.1 ml劑量0.5 μg[8-9]和0.1 μg[1]?？紤]到本實(shí)驗(yàn)均為單個(gè)抗原，因此，在此基礎(chǔ)上將抗原最高濃度提高至每0.1 ml劑量5 μg。

表1 用于豚鼠皮膚試驗(yàn)所篩選的結(jié)核分枝桿菌抗原

五、豚鼠致敏及皮膚試驗(yàn)

1.分組：共18只豚鼠，分為高(5 μg)、中(0.5 μg)、低(0.1 μg)劑量3組，每組6只，每只豚鼠注射6種蛋白，重復(fù)3次。

2.致敏豚鼠：(1)準(zhǔn)備菌液：磨菌，測(cè)量菌液在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度(A600)值，使A600=1[菌液濃度為3.8×108菌落形成單位(CFU)/ml]，稀釋10倍，使菌液終濃度為3.8×107CFU/ml。(2)致敏：每只豚鼠大腿腹股溝皮下注射0.5 ml H37Rv菌液，感染4周。

3.皮膚試驗(yàn)：豚鼠背部去毛，用1 ml注射器皮內(nèi)注射。TB-PPD和各抗原均注射0.1 ml，注射24 h 和48 h后測(cè)量硬結(jié)橫徑和縱徑，計(jì)算硬結(jié)平均直徑[(橫徑+縱徑)/2]。

4.判斷標(biāo)準(zhǔn)：以硬結(jié)平均直徑<5 mm為陰性，≥5 mm為陽(yáng)性，凡有水皰和壞死者均屬于強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)[3, 8]。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用Microsoft Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料為偏態(tài)分布，以“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1，Q3)]”表示，采用配對(duì)樣本比較的Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)分析各抗原注射24 h和48 h后硬結(jié)平均直徑的差異；采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)比較多組抗原之間硬結(jié)平均直徑的差異，雙側(cè)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、抗原表達(dá)純化結(jié)果

共表達(dá)12種MTB抗原，其中8種為包涵體形式，采用BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量法檢測(cè)蛋白濃度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 12種結(jié)核分枝桿菌抗原的表達(dá)純化情況

二、各抗原皮膚試驗(yàn)反應(yīng)情況

抗原劑量為5 μg時(shí)，多數(shù)抗原皮膚試驗(yàn)反應(yīng)24 h 時(shí)的硬結(jié)平均直徑均大于反應(yīng)48 h，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而MPT64、Rv1985c、Rv0222和Rv1738等皮膚試驗(yàn)反應(yīng)24 h和48 h的硬結(jié)平均直徑差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)?？乖瓌┝繛?.5 μg時(shí)，Rv1985c和Rv1738皮膚試驗(yàn)無(wú)任何反應(yīng)；Rv3872、Rv0222、Rv3619c、Rv3425和Rv2626c等皮膚試驗(yàn)反應(yīng)24 h和48 h的硬結(jié)平均直徑差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他抗原皮膚試驗(yàn)反應(yīng)24 h的硬結(jié)平均直徑均大于反應(yīng)48 h(表4)?？乖瓌┝繛?.1 μg 時(shí)，11種抗原皮試均無(wú)任何反應(yīng)。皮膚試驗(yàn)反應(yīng)24 h時(shí)，TB-PPD(5 IU)和EC(0.5 μg劑量)的反應(yīng)均為陽(yáng)性(9/9，9/9)；在5 μg劑量時(shí)，Rv3120和Rv3619c的皮膚試驗(yàn)效果相對(duì)較好，反應(yīng)陽(yáng)性率分別為9/9、8/9；在0.5 μg劑量時(shí)，MPT64和Rv3120的皮膚試驗(yàn)效果相對(duì)較好，反應(yīng)陽(yáng)性率分別為7/7、6/7。MPT64(0.5 μg劑量)、Rv3120(5 μg劑量)和Rv3619c(5 μg劑量)皮膚試驗(yàn)反應(yīng)24 h硬結(jié)平均直徑中位數(shù)均>5 mm。

三、幾種優(yōu)勢(shì)抗原皮膚試驗(yàn)結(jié)果分析

皮膚試驗(yàn)反應(yīng)24 h時(shí)，TB-PPD(5 IU)、EC(0.5 μg 劑量)、MPT64(0.5 μg劑量)、Rv3120(5 μg劑量)和Rv3619c(5 μg劑量)硬結(jié)平均直徑差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.064，P=0.000)；EC(0.5 μg劑量)硬結(jié)平均直徑明顯大于TB-PPD(5 IU)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(H=-2.976，P=0.029)。MPT64(0.5 μg劑量)、Rv3120(5 μg劑量)和Rv3619c(5 μg劑量)與TB-PPD(5 IU)硬結(jié)平均直徑接近，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H值分別為-0.496、0.819和1.714，P值分別為1.000、1.000和0.865)；MPT64(0.5 μg劑量)與EC(0.5 μg劑量)硬結(jié)平均直徑接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=2.288，P=0.221)。Rv3120(5 μg劑量)和Rv3619c(5 μg劑量)硬結(jié)平均直徑均小于EC(0.5 μg劑量)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H值分別為3.795和4.690，P值分別為0.001和0.000)。

表3 抗原劑量為5 μg時(shí)豚鼠皮膚試驗(yàn)反應(yīng)不同時(shí)間硬結(jié)平均直徑[mm，M(Q1，Q3)]

表4 抗原劑量為0.5 μg時(shí)豚鼠皮膚試驗(yàn)反應(yīng)不同時(shí)間硬結(jié)平均直徑[mm，M(Q1，Q3)]

皮膚試驗(yàn)反應(yīng)48 h時(shí)，TB-PPD(5 IU)、EC(0.5 μg 劑量)、MPT64(0.5 μg劑量)、Rv3120(5 μg劑量)和Rv3619c(5 μg劑量)硬結(jié)平均直徑差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.801，P=0.000)。TB-PPD(5 IU)和EC(0.5 μg劑量)硬結(jié)平均直徑差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=-1.573，P=1.000)；MPT64(0.5 μg 劑量)、Rv3120(5 μg劑量)和Rv3619c(5 μg劑量)與TB-PPD(5 IU)硬結(jié)平均直徑接近，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H值分別為-0.262、2.241和2.608，P值分別為1.000、0.250和0.091)； MPT64(0.5 μg劑量)與EC(0.5 μg劑量)硬結(jié)平均直徑接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=1.209，P=1.000)；Rv3120(5 μg 劑量)和Rv3619c(5 μg劑量)硬結(jié)平均直徑均小于EC(0.5 μg劑量)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H分別為3.814和4.181，P分別為0.001和0.000)。

討 論

目前，對(duì)MTB感染皮膚試驗(yàn)抗原成分的研究是提高結(jié)核病診斷的重要方法。通過(guò)對(duì)RD區(qū)的研究，發(fā)現(xiàn)利用BCG的缺失區(qū)以及采用不同的缺失區(qū)蛋白抗原聯(lián)合進(jìn)行皮膚試驗(yàn)，可以在一定程度上提高其對(duì)結(jié)核病診斷的特異性和敏感性[10]。RD1區(qū)的EC抗原是近年來(lái)研究較多的抗原，其具有較高特異性，但敏感性尚不盡如人意[11]。而且，Hur等[12]提出由于MTB抗原表位的復(fù)雜性及患者免疫功能的個(gè)體差異，基于此融合抗原的檢測(cè)仍然存在局限性，僅依靠EC抗原多肽不足以覆蓋MTB引起宿主免疫反應(yīng)的所有表位。因此，本研究表達(dá)了除EC抗原以外的11種抗原，對(duì)RD區(qū)及MTB休眠相關(guān)抗原的皮膚試驗(yàn)效果進(jìn)行研究，以了解其他抗原引起的遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed-type hypersensitivity，DTH)，提高其診斷結(jié)核病的特異性和敏感性。

豚鼠皮膚試驗(yàn)反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間較早，一般在注射24 h后反應(yīng)就出現(xiàn)且比較恒定[8]。本研究結(jié)果顯示，劑量為5 μg或0.5 μg時(shí)，多數(shù)抗原的皮膚試驗(yàn)反應(yīng)24 h時(shí)硬結(jié)平均直徑均明顯大于反應(yīng)48 h，包括皮試效果相對(duì)較好的抗原Rv3120(5 μg劑量)、Rv3619c(5 μg劑量)和MPT64(0.5 μg劑量)在24 h 和48 h硬結(jié)平均直徑均有顯著差異，與都偉欣等[8]的報(bào)道不一致。究其原因，可能是MTB致敏濃度及豚鼠的個(gè)體差異所致。MTB通常在感染機(jī)體4周時(shí)達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)期，但其穩(wěn)定期的細(xì)菌數(shù)與最初感染的細(xì)菌數(shù)量有關(guān)，而且MTB的濃度高低對(duì)機(jī)體免疫能力的影響有一定的差異[13-14]。

皮膚試驗(yàn)反應(yīng)硬結(jié)的大小，與皮試抗原劑量的多少有一定的關(guān)系[15]。本研究結(jié)果顯示，多數(shù)抗原5 μg劑量，比0.5 μg劑量的皮試反應(yīng)效果好，而MPT64則在劑量為0.5 μg時(shí)皮試反應(yīng)效果相對(duì)較好。其中，皮試反應(yīng)效果相對(duì)較好的Rv3120(5 μg劑量)、Rv3619c(5 μg劑量)和MPT64(0.5 μg劑量)的反應(yīng)陽(yáng)性率分別為9/9、8/9和7/7。Rv3120(5 μg劑量)和MPT64(0.5 μg劑量)與TB-PPD(5 IU)皮膚試驗(yàn)反應(yīng)(24 h)硬結(jié)平均直徑差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且其反應(yīng)均為陽(yáng)性(硬結(jié)平均直徑≥5 mm)，表明這兩種抗原具有較好的免疫原性。MPT64是MTB早期培養(yǎng)濾液主要的分泌蛋白之一，對(duì)MTBC有高特異性[6]。其能刺激γ干擾素(IFN-γ)的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，引起小鼠和豚鼠的T細(xì)胞反應(yīng)和DTH[16-17]。重組蛋白CFP21-MPT64在檢測(cè)LTBI家庭密切接觸者時(shí)的敏感度(66.7%)略高于PPD皮膚試驗(yàn)(61.1%)[6]。因此，可考慮將MPT64與其他抗原聯(lián)合使用，進(jìn)一步研究。Rv3120屬于RD5區(qū)抗原，是一種假定蛋白，雖與重組結(jié)核桿菌融合蛋白(EC)相比(24 h和48 h)，皮試反應(yīng)大小有顯著差異，但Zhang等[5]對(duì)60例HIV陰性肺結(jié)核患者和32名健康對(duì)照者的血清進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，結(jié)果顯示，與已知抗原ESAT-6(敏感度為21.7%，特異度為90.6%)相比，Rv3120抗原具有更高的敏感度和特異度(敏感度為31.7%，特異度為96.9%)，可作為結(jié)核病免疫診斷的候選蛋白。Rv3619c屬于ESAT-6家族的早期分泌性抗原，能誘導(dǎo)抗原特異性IFN-γ的分泌和Th1型反應(yīng)。研究證明，Rv3619c能誘導(dǎo)MTB感染的豚鼠發(fā)生DTH，是有效的T細(xì)胞抗原[18-20]。本研究結(jié)果顯示，Rv3619c(5 μg劑量)皮膚試驗(yàn)反應(yīng)(24 h)硬結(jié)平均直徑明顯小于TB-PPD(5 IU)和EC，但其硬結(jié)平均直徑大于陽(yáng)性臨界值(5 mm)，反應(yīng)陽(yáng)性率較高(8/9)，在結(jié)核病診斷中有潛在價(jià)值。研究表明，部分MTB休眠相關(guān)抗原在LTBI人群中誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)要明顯強(qiáng)于結(jié)核病患者[21]，而且不同抗原在LTBI人群中的血清抗體水平也不一樣[22]。本研究中，MTB休眠相關(guān)抗原Rv1738和Rv2626c在致敏豚鼠身上均未能顯示出明顯的DTH反應(yīng)，其可能原因是感染后的豚鼠已處于MTB活躍狀態(tài)；同時(shí)，推測(cè)DTH主要由早期表達(dá)的蛋白引起，尤其是早期分泌型的蛋白。這為進(jìn)一步優(yōu)化皮膚試驗(yàn)試劑提供了研發(fā)方向。

目前，檢測(cè)MTB感染的皮膚試驗(yàn)試劑不斷改進(jìn)，在使用效果方面，在減輕和減少不良反應(yīng)的同時(shí)，DTH的特征更加明顯，特異性和敏感性也進(jìn)入一個(gè)新的高度。但是，目前新型的以ESAT-6和CFP-10抗原為主的C-Tb試劑仍然存在紅腫發(fā)生率高[23]，DTH表現(xiàn)不夠明顯的問(wèn)題；而抗原的聯(lián)合使用有助于提高M(jìn)TB感染的診斷效果[24]。本研究目前尚處于蛋白抗原篩選階段，深入的蛋白組合及其最優(yōu)劑量等方面尚需進(jìn)一步研究，以期克服目前重組抗原EC等試劑存在的不足。