何雪冬， 王 嫻

(1.解放軍第一四九醫(yī)院， 江蘇 連云港 222042 2.江蘇省連云港市第一人民醫(yī)院， 江蘇 連云港 222002)

瘢痕疙瘩是皮膚傷口愈合或者由不明原因?qū)е缕つw損傷愈合后形成的過度生長的異常瘢痕組織，臨床表現(xiàn)為瘢痕疙瘩成纖維細胞大量異常增殖，真皮結(jié)締組織發(fā)生纖維化[1]，出現(xiàn)疼痛、瘙癢等癥狀，不僅影響美觀，還影響患者正常生活，一般發(fā)生于易感個體皮膚損傷引起的異常傷口愈合反應(yīng)[2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類小的、非編碼內(nèi)源性RNA分子，由18～25個核苷酸組成，可以通過轉(zhuǎn)錄后降解目標(biāo)信使RNA(mRNA)或通過與3 '端非翻譯區(qū)(3'-untranslated region，3'-UTR)結(jié)合來抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)基因表達，參與細胞生長、增殖、分化、凋亡等生理活動[3]。據(jù)報道，miRNA-23b在造血干細胞的產(chǎn)生及分化中起重要作用[4]，并有報道稱下調(diào)miRNA-23b-3p，可調(diào)控苦瓜蛋白高表達，降低胞內(nèi)脂質(zhì)積累[5]。notch1蛋白主要在細胞質(zhì)和細胞核中表達，可能在瘢痕癌的形成中發(fā)揮作用[6]。本研究通過檢測瘢痕疙瘩成纖維細胞中miR-23b和notch1蛋白的表達量，探究二者間作用關(guān)系及臨床意義。

1 資料與方法

1.1臨床資料:收集2017年12月至2019年11月在解放軍第一四九醫(yī)院就診的瘢痕疙瘩患者130例，手術(shù)過程中取每位患者瘢痕組織及周圍正常真皮組織。所有患者經(jīng)臨床和病理確診后，均排除惡性病變。根據(jù)瘢痕疙瘩的嚴重程度將其分為輕度65例、中度43例及重度22例。納入標(biāo)準：①皮膚損傷超過原有損傷范圍并侵犯周圍正常皮膚；②經(jīng)手術(shù)切除后又復(fù)發(fā)者；③瘢痕病程超過6個月無痊愈者。只要符合其中一項即可納入研究。排除標(biāo)準：①妊娠或哺乳期婦女；②凝血功能異常者；③有腫瘤病史；④臨床資料不完整。本研究經(jīng)解放軍第一四九醫(yī)院倫理委員會批準；患者均簽署知情同意書。

1.2主要儀器及試劑:CFX96型實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-RAD公司；DMi8型倒置顯微鏡購自德國徠卡公司。DMEM培養(yǎng)基(批號：KL-P0032)購自上?？道噬锟萍加邢薰?；Trizol試劑盒(批號：ALH011-TUH)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：ALH266-PTO)購自北京百奧萊博科技有限公司；實時熒光定量PCR試劑盒(批號：SQ-13397)購自美國UNIBIOTEST公司；鼠抗人notch1單克隆抗體(批號：MAB11063)購自艾美捷科技有限公司；兔抗鼠IgG多克隆抗體(批號：C1707)購自北京普利萊(APPLYGEN)基因技術(shù)有限公司。

1.3方 法

1.3.1瘢痕疙瘩及正常真皮組織中成纖維細胞的提取、培養(yǎng):將收集的瘢痕疙瘩組織標(biāo)本剪碎后，加入3mg/mLⅡ型中性蛋白酶于4℃下隔夜消化，棄去上皮；將正常真皮組織標(biāo)本剪碎后加入Ⅰ型膠原酶，于37℃恒溫箱中消化2h，之后加入Dnase Ⅰ終止液終止消化。將懸浮液于4℃下，2000r/min離心15min，棄去上清液，重懸細胞，再經(jīng)過濾、離心后加入10mL DMEM增殖培養(yǎng)液懸浮，接種至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，利用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

1.3.2實時熒光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR)技術(shù)檢測miR-23b水平:利用qRT-PCR技術(shù)檢測瘢痕疙瘩及正常真皮組織成纖維細胞中miR-23b水平。用Trizol試劑盒提取總RNA，注意防止RNA酶污染。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴增試劑盒均嚴格按照說明書操作步驟執(zhí)行，以U6為內(nèi)參基因。循環(huán)參數(shù)：95℃，預(yù)變性3min；90℃，變性25s；60℃，退火20s；75℃，延伸40s，共40個循環(huán)。引物序列由生工生物工程公司合成，miR-23b上游引物：5'-CTTCCTAGGGGATTTCAG-3'，下游引物：5'-GCCCCACAGGAACAAGTCC T-3'；U6上游引物：5'-ATTGGAACGATACAGAGAA-3'，下游引物：5'-GGAACGCTTCACGA ATTTG-3'。用2-△△Ct法計算miR-23b相對表達量。

1.3.3免疫組化法檢測notch1蛋白水平:采用免疫組化法檢測notch1蛋白水平，所有組織標(biāo)本經(jīng)4%福爾馬林溶液固定，脫水后侵蠟包埋，凝固后切片4μm，每個標(biāo)本切2片，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行。Notch1蛋白陽性結(jié)果以染色為淡黃色或黃棕色為主，根據(jù)陽性細胞所占比例及細胞染色強度綜合評分進行半定量分析[7]。根據(jù)陽性細胞所占觀察細胞的比例評分：<25%記為1分，25%≤陽性細胞比例<50%的記為2分，50%≤陽性細胞比例<75%的記為3分，≥75%的記為4分；根據(jù)細胞染色強度評分：無染色的記為0分，染色為淡黃色的記1分，染為黃色的記3分，染成黃棕色的記4分。將兩組結(jié)果作乘積，總分<3分定義為陰性，≥3分定義為陽性。

2 結(jié) 果

2.1一般資料分析:瘢痕疙瘩患者130例，其中男58例，女72例，男女比例1:1.24。年齡21～67歲，平均年齡(34.27±10.23)歲。病程最短3個月，最長28年。130例患者皮損單發(fā)者83(63.85%)例，多發(fā)者47(36.15%)例，有家族史者19(14.62%)例。130例瘢痕疙瘩患者共有203個皮損，其中胸部78(38.42%)個，肩背部59(29.07%)個，四肢40(19.71%)個，耳部13(6.40%)個，腹部8(3.94%)個，腰臀部5(2.46%)個。皮損累積面積為大瘢痕6例(4.61%)，中瘢痕57例(43.85%)，小瘢痕67例(51.54%)。

圖1 Notch1在正常真皮組織(A)和瘢痕疙瘩組織(B)中的表達(HE染色，×400)

2.2miR-23b、notch1在正常組織和瘢痕疙瘩組織成纖維細胞中的表達比較:與正常真皮組織相比，瘢痕疙瘩組織成纖維細胞中miR-23b mRNA水平、notch1陽性表達率均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由免疫組化染色，notch1主要在細胞質(zhì)和細胞核中表達，在細胞膜中也稍有表達，見表1和圖1。

2.3瘢痕疙瘩嚴重程度與miR-23b mRNA、notch1的表達關(guān)系:MiR-23b mRNA、notch1在瘢痕疙瘩不同臨床分級之間表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且隨瘢痕疙瘩病情加重，miR-23b mRNA水平及notch1陽性表達率呈上升趨勢,見表2。

表1 miR-23b mRNA notch1蛋白在正常組織和瘢痕疙瘩組織成纖維細胞中的表達

表2 瘢痕疙瘩嚴重程度與notch1的表達關(guān)系

2.4瘢痕疙瘩組織成纖維細胞中miR-23b和notch1表達關(guān)系:Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，瘢痕疙瘩組織成纖維細胞中miR-23b和notch1呈正相關(guān)(r=0.529，P<0.05)。從miRTarBase數(shù)據(jù)庫中可得，miR-23b靶向notch1的表達，共有3段靶向序列，見圖2、圖3。

圖2 miR-23b和notch1的表達關(guān)系

圖3 miR-23b靶向notch1的表達序列

3 討 論

瘢痕疙瘩是一種良性皮膚纖維增生性腫瘤，是由皮膚損傷后傷口異常愈合引起的，臨床特征為細胞外基質(zhì)過度增生，疤痕組織逐漸侵犯周圍正常組織，直至超出原始創(chuàng)傷區(qū)域[8]，且疤痕不會隨時間的推移而消退。瘢痕疙瘩的常用治療方法有按摩、壓力治療、手術(shù)切除、放療等單獨或聯(lián)合治療[9,10]，但臨床結(jié)果顯示單一治療的效果不如聯(lián)合治療。近年來，人們越來越多地關(guān)注miRNA對與瘢痕疙瘩的作用機制。有研究發(fā)現(xiàn)[11]，過表達miR-34a的瘢痕疙瘩成纖維細胞在p53等凋亡信號通路相關(guān)基因表達上存在差異，推測miRNA可能參與病變形成與修復(fù)之間的平衡。據(jù)報道，miR-23b-3p與細胞增殖、侵襲和凋亡有關(guān)，是許多癌癥的診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，其通過表達下調(diào)促進癌細胞增殖，導(dǎo)致預(yù)后不良[12]。然而關(guān)于miR-23b在瘢痕疙瘩組織中的研究鮮有報道。Lyu等[13]通過miRNA芯片分析比較瘢痕疙瘩組織成纖維細胞和正常成纖維細胞的miRNA表達譜差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有9種miRNA差異性表達，在瘢痕疙瘩組織成纖維細胞中顯著上調(diào)的6種miRNA中包括miR-23b-3p。本研究結(jié)果顯示，與正常真皮組織相比，miR-23b在瘢痕疙瘩組織中呈高表達狀態(tài)，與上述結(jié)果一致，且隨著患者病情加重，miR-23b相對表達量呈上升趨勢，推測miR-23b可能與瘢痕疙瘩的形成有關(guān)。

研究表明，notch信號途徑廣泛存在于生物體中，在生物個體生長發(fā)育、細胞分化及增殖凋亡等生命活動中起重要調(diào)控作用[14]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[15]，在鼻咽癌notch1敲除細胞中，notch1水平下調(diào)，細胞增殖、遷移和侵襲受到明顯抑制，提示notch1可能成為鼻咽癌臨床治療的新靶點。另有報道稱[6]，notch1在增生性瘢痕組織中高表達，陽性率為92.86%，說明notch1高表達促進角質(zhì)細胞過度分化，促進增生性瘢痕的形成。本研究結(jié)果顯示，與正常真皮組織相比，瘢痕疙瘩組織中notch1蛋白陽性率較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而且隨著瘢痕疙瘩臨床分級加重，notch1陽性表達率逐漸上升，提示notch1蛋白高表達可能促進成纖維細胞的增殖，參與瘢痕疙瘩的形成。另外，本研究發(fā)現(xiàn)miR-23b和notch1呈正相關(guān)關(guān)系，提示miR-23b和notch1可能對瘢痕疙瘩的形成均起到積極作用，但具體的作用模式尚不明確，有待進一步研究。

綜上所述，與正常真皮組織相比，miR-23b和notch1在瘢痕疙瘩組織中均呈高表達，且二者呈正相關(guān)關(guān)系，可能同時參與瘢痕疙瘩的形成、發(fā)展過程，但其具體作用機制有待進一步研究。