錢(qián) 坤

（天津市農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心，天津 300402）

通過(guò)多重PCR技術(shù)進(jìn)行CSFV與PRRSV檢測(cè)分析，可以有效的確診其具體的類(lèi)型，分析其是否為單一性或者混合型的病毒類(lèi)型。多重PCR技術(shù)在養(yǎng)殖行業(yè)中應(yīng)用可以有效的滿足臨床大批量的檢測(cè)要求，效果顯著。

1 CSFV與PRRSV檢測(cè)方法的建立

豬繁殖障礙性疾病是一種危害養(yǎng)豬場(chǎng)的嚴(yán)重疾病，給生豬養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。此種疾病具有一定的傳染性。而豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）兩種病毒的臨床癥狀較為類(lèi)似，近些年存在多種病毒綜合感染的問(wèn)題，單純的通過(guò)臨床癥狀無(wú)法確診。傳統(tǒng)的技術(shù)手段檢測(cè)周期長(zhǎng)，在實(shí)驗(yàn)室以及進(jìn)行臨床上的大批量檢測(cè)中無(wú)法滿足實(shí)際的檢測(cè)要求。

多重PCR技術(shù)也稱之為多重引物PCR以及符合PCR技術(shù)手段，是通過(guò)在相同的PCR反應(yīng)系統(tǒng)中添加兩對(duì)及以上的引物，通過(guò)同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增處理產(chǎn)生多個(gè)基因片段PCR反應(yīng)的方式進(jìn)行檢驗(yàn)，是現(xiàn)階段在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中常見(jiàn)的分子生物學(xué)檢測(cè)手段。

此種方式檢測(cè)靈敏性較高，具有節(jié)省材料、經(jīng)費(fèi)的優(yōu)勢(shì)，可以通過(guò)一次反應(yīng)檢測(cè)多個(gè)病院，適合多種病原體的緩和性感染檢測(cè)，具有快速診斷的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)PCR機(jī)械進(jìn)行處理，可以同時(shí)檢測(cè)三種病毒，此種方式在臨床中應(yīng)用效果顯著。

2 CSFV與PRRSV檢測(cè)方法的應(yīng)用

2.1 方法

2.1.1 引物設(shè)計(jì)與合成。根據(jù)三種病毒標(biāo)準(zhǔn)參考毒株基因序列進(jìn)行選擇，選擇保守基因，進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)，通過(guò)稀釋，在-20℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 提取DNA以及RNA。通過(guò)對(duì)病豬組織樣品研磨處理，加入適當(dāng)?shù)纳睇}水進(jìn)行搖勻，放在-20℃的環(huán)境中反復(fù)的凍融三次；將其放在8000rpm/min中進(jìn)行3min的離心處理，獲得上清液，將其放在1.5ml的滅菌離心管之中，根據(jù)要求進(jìn)行操作，檢測(cè)合格之后放在-20℃環(huán)境保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 RNA病毒模板植被。選擇提取好的病毒，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄實(shí)際說(shuō)明書(shū)進(jìn)行三種病毒的處理，檢測(cè)合格之后將其放在-20℃的環(huán)境中進(jìn)行保存。

2.1.4 單項(xiàng)PCR檢測(cè)方法建立。根據(jù)引物濃度，在退火溫度條件之后通過(guò)反復(fù)的試驗(yàn)分析確定最佳的單項(xiàng)PCR最佳反應(yīng)條件。

2.1.5 多重PCR檢測(cè)方法建立。基于三種病毒的單項(xiàng)PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)，優(yōu)化PCR的各項(xiàng)條件。

2.1.6 PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化。通過(guò)將提取DNA以及c DNA為主要模板，分別在50℃、52℃以及54℃、58℃、60℃溫度狀態(tài)中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行擴(kuò)增處理，達(dá)到優(yōu)化退火溫度參數(shù)的目的，確定其最佳的退火溫度。

2.1.7 多重PCR靈敏性試驗(yàn)。過(guò)混合3種病毒核酸，通過(guò)ddH 20進(jìn)行10倍稀釋處理，通過(guò)模板進(jìn)行PCR分析。

2.1.8 多重PCR特異性試驗(yàn)。通過(guò)優(yōu)化操作體系、實(shí)驗(yàn)程序進(jìn)行處理，通過(guò)三種病毒的混合物作為模板，將陽(yáng)性與陰性進(jìn)行對(duì)照分析，進(jìn)行多重PCR進(jìn)行處理。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn)。構(gòu)建多重PCR，通過(guò)反應(yīng)體系以及程序進(jìn)行重復(fù)性的檢驗(yàn)，分析結(jié)果是否可靠。

2.2 結(jié)果

2.2.1 PCR擴(kuò)增。通過(guò)單項(xiàng)、多重?cái)U(kuò)增檢查，通過(guò)分析可以確定3對(duì)PCR擴(kuò)增的目的條帶大小符合預(yù)期，陰性對(duì)照并沒(méi)有擴(kuò)增出條帶。

2.2.2 多重PCR退火溫度優(yōu)化。通過(guò)選擇50℃、52℃以及54℃、56℃、58℃以及60℃的退火溫度，進(jìn)行多重PCR分析，根據(jù)結(jié)果確定在退火溫度不同狀態(tài)之下對(duì)最終的擴(kuò)增結(jié)果并不會(huì)產(chǎn)生較大的影響。通過(guò)分析確定將54℃作為最佳的多重PCR退火溫度。

2.2.3 靈敏性檢驗(yàn)結(jié)果。通過(guò)優(yōu)化處理的條件進(jìn)行擴(kuò)增10倍稀釋的CSFV獲得其最低檢測(cè)量的結(jié)果為39.3pg；PRRSV 55.1 pg的c DNA和DNA混合液最低檢測(cè)量分別為39.3pg、1.32pg.

2.2.4 特異性檢驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)已經(jīng)優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)分析，通過(guò)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)其并沒(méi)有擴(kuò)增出條帶，而CSFV、PRRSV混合模板則存在清晰的條帶，其屬于目的片段，表明PCR特異性特征良好。

2.2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。構(gòu)建多重PCR分析，了解不同時(shí)間段不同陽(yáng)性樣品參數(shù)信息，重復(fù)檢測(cè)3次之后如果結(jié)果相同則表明多重PCR較為穩(wěn)定。

2.2.6 多重PCR臨床樣品檢測(cè)結(jié)果。分析母豬組織樣品，根據(jù)操作進(jìn)行多重PCR的檢測(cè)分析，其結(jié)果如表1：

通過(guò)分析可以確定多重PCR檢測(cè)結(jié)果與單一的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果相同。

3 結(jié)束語(yǔ)

多重PCR檢測(cè)方法檢測(cè)效果顯著，具有敏感性高、重復(fù)性良好的特點(diǎn)。通過(guò)多重PCR方式進(jìn)行檢測(cè)分析，可以檢測(cè)兩種病毒單一狀態(tài)或者混合感染。通過(guò)免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行處理，在檢測(cè)中通過(guò)進(jìn)行免疫組織的化學(xué)染色方式，結(jié)果精準(zhǔn)可靠，可以有效檢測(cè)兩種病毒。