杜洪志，丘米佳，劉旭潔，陳子愉，蒙燕瑤，劉時宋，李 瑋

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

對葉百部為百部科植物對葉百部StemonatuberosaLour.的干燥塊根。味甘、苦，性微溫，歸肺經(jīng)。具有潤肺止咳、殺蟲滅虱之功。主治風(fēng)寒咳嗽、百日咳、肺結(jié)核、疥癬、濕疹等病癥[1]。主要含有對葉百部堿、新對葉百部堿等生物堿類化合物[2]，而非生物堿主要包括蛋白質(zhì)、氨基酸、香豆素、多糖、有機(jī)酸等成分[3-4]。其中生物堿為主要止咳藥效部位[5-6]，其他水煎液和非生物堿部分均具有一定的止咳活性[7]。由于該藥材有小毒，故臨床上生品多外用，內(nèi)服宜用蜜炙品。對葉百部蜜炙后能增強(qiáng)潤肺止咳之功，主要有效部位為生物堿，但水煎液也有一定作用[8]。然而，由于生物堿取代基的不同，化學(xué)極性不同，采用化學(xué)溶劑提取分離成分時，不同極性生物堿在不同溶劑中分布不同，哪個部位為主要有效部位，目前相關(guān)研究較少。

基于此，本文以對葉百部為研究對象，根據(jù)2015年版《中國藥典》炮制通則中“蜜炙法”進(jìn)行飲片炮制，通過不同極性溶劑的提取分離和富集，得到不同極性部位，采用氨水引咳試驗(yàn)及氣管酚紅檢測試驗(yàn)，結(jié)合咳嗽抑制率及酚紅排泄量，采用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計處理，研究對葉百部蜜炙前后飲片及不同極性部位的止咳化痰作用，旨在為對葉百部發(fā)揮止咳化痰功效的炮制提供理論支持，找到相關(guān)作用的有效部位。

1 材料

1.1 儀器

TU-1810型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，ME204E型萬分之一電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，YQ-1000A超聲清洗儀(上海易凈超聲波儀器有限公司)；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 動物

KM小鼠，SPF級，體重18±22 g，雌雄各半，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，試驗(yàn)動物合格證號：SCXK(湘)2014-0011，分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，室溫20～25 ℃，相對濕度40%～60%。

1.3 試藥

氨酚雙氫可待因片(國藥準(zhǔn)字號：H20030920，10 mg/片，威海路坦制藥有限公司)；氯化銨片(國藥準(zhǔn)字號：H33021829，浙江康恩貝股份制藥有限公司)；酚紅(批號：20181009，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；CMC-Na(批號：20140702，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；生理鹽水(批號：H2016004，貴州科倫藥業(yè)有限公司)；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等試劑均為分析純，蒸餾水為實(shí)驗(yàn)室自制。

對葉百部藥材采自貴州省遵義市正安縣，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定為百部科植物對葉百部StemonatuberosaLour.的根莖。

2 方法和結(jié)果

2.1 對葉百部生品、蜜炙品的制備

根據(jù)2015年版《中國藥典》中對葉百部加工炮制方法：取鮮品藥材，除去須根，洗凈泥土，晾干，置蒸制容器中蒸至內(nèi)無白心，取出，切成厚片，60 ℃烘干，除去雜質(zhì)，即得生品飲片；再根據(jù)炮制通則中“蜜炙法”，取生品飲片，大小分檔，加入煉蜜(每100 kg藥材用煉蜜12.5 kg)，攪拌均勻，悶潤至透，置預(yù)熱的炒制容器中，文火加熱，不斷翻炒至表面顏色加深，呈褐棕色或棕黃色，略帶黏性不粘手時，取出，攤開放涼。

2.2 對葉百部生品、蜜炙品不同極性部位的制備

取對葉百部生品、蜜炙品粗粉(20目)，加10倍量70%的乙醇回流提取3次，每次1 h，過濾，合并濾液，55 ℃減壓回收溶劑得濃縮液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，每次萃取到溶液顏色不再變化，合并相同萃取液，再減壓回收溶劑，即分別得到生品、蜜炙品的70%乙醇提取物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。

2.3 各給藥組溶液配制

根據(jù)前期給藥劑量篩選及相關(guān)文獻(xiàn)報道[8]，將各極性部位用0.3%的CMC-Na蒸餾水溶液進(jìn)行溶解，配制成含生藥量為1.2 g/mL的給藥溶液，陽性藥可待因的給藥量按照成人與小鼠換算系數(shù)，小鼠以20 g計，成人以70 kg計算，得到用量為0.78 mg/mL的給藥溶液，分別置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 氨水引咳試驗(yàn)

昆明種小鼠，雌雄各半，禁食不禁水12 h。置于1000 mL大燒杯中，罩住燒杯口，用噴霧器均勻噴入濃氨水1 mL，通過氨水刺激后，引發(fā)咳嗽，觀察咳嗽潛伏期和咳嗽次數(shù)，以小鼠腹肌收縮、張大口、有咳嗽聲為準(zhǔn)，以1 min內(nèi)咳嗽次數(shù)大于3次者為初篩合格小鼠。

取經(jīng)過初篩合格的小鼠，隨機(jī)分為12組，每組10只，雌雄各半，依次為空白對照組，ig給予0.3%的羧甲基纖維素鈉；陽性藥組，ig給予氨酚雙氫可待因片；生品及蜜炙品的70%乙醇提取物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位，ig給藥。給藥容積為0.1 mL/10 g，連續(xù)給藥6 d，并記錄體重。末次給藥胃后2 h，進(jìn)行止咳試驗(yàn)，觀察并記錄各給藥組小鼠咳嗽潛伏期和2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)。計算咳嗽抑制率和止咳活性。

咳嗽抑制率=(空白對照組咳嗽數(shù)-給藥組咳嗽次數(shù))/空白對照組×100%

止咳活性=給藥組咳嗽抑制率/可待因組咳嗽抑制率×100%

2.5 小鼠化痰試驗(yàn)

取一定量酚紅粉末約0.005 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，用5% 碳酸氫鈉溶液定容至刻度，配成濃度為100 μg/mL的樣液，精密吸取樣液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、1.0 mL、2.0 mL于100 mL量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，取稀釋液于波長558 nm處測定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，酚紅劑量(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=0.1845C-0.0136(R=0.9995，n=5)，結(jié)果表明酚紅量在0.1～2.0 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

取KM小鼠120只，根據(jù)2.4項(xiàng)下“氨水引咳試驗(yàn)”組別隨機(jī)分為12組，連續(xù)給藥6 d，末次給藥1 h后，腹腔注入0.25%酚紅溶液0.1 mL/10 g，30 min 后將小鼠脫頸處死，剝離氣管周圍組織，剪下從甲狀軟骨到氣管分支處的一段氣管，用5%的碳酸氫鈉溶液沖洗氣管3次，每次0.5 mL，合并洗液，3000 r/min離心20 min，取上清液，在波長為558 nm處檢測吸光度，計算小鼠酚紅排泌量。

2.6 統(tǒng)計方法

2.7 對葉百部生品和蜜炙品不同極性部位止咳化痰作用結(jié)果

氨水引咳試驗(yàn)中，觀察記錄各組小鼠的初次咳嗽時間、2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)、咳嗽抑制率及止咳活性，結(jié)果見表1；小鼠化痰試驗(yàn)中，檢測并計算酚紅排泄量，結(jié)果見表2。

表1 對葉百部不同極性部位的止咳試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Antitussive test results of different polar components of Stemona tuberosa Lour.

由表1可得，與空白對照組比較，各給藥組的咳嗽潛伏期(炙品水部位除外)和咳嗽次數(shù)均具有極顯著性差異(P<0.01)；與陽性藥可待因組比較，生品石油醚部位、炙品70%乙醇提取物、炙品石油醚部位、炙品乙酸乙酯部位的咳嗽潛伏期不具有顯著性差異(P>0.05)，炙品石油醚部位、炙品乙酸乙酯部位的咳嗽次數(shù)不具有顯著性差異(P>0.05)，結(jié)果表明對葉百部提取物及各極性部位具有良好的止咳作用，其中，蜜炙后止咳作用較好。

通過咳嗽抑制率和止咳活性比較，生品和蜜炙品中均以石油醚部位和乙酸乙酯部位表現(xiàn)出良好的止咳活性，且石油醚部位均強(qiáng)于乙酸乙酯部位；同時，蜜炙品明顯強(qiáng)于生品，其中以蜜炙品石油醚部位最強(qiáng)，咳嗽抑制率為56.17%，止咳活性為89.58%；其次以蜜炙品乙酸乙酯部位較強(qiáng)，咳嗽抑制率為53.03%，止咳活性為84.56%；此外，不管是生品還是蜜炙品，水部位的止咳活性最差。

表2 對葉百部不同極性部位的化痰試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Expectorant test results of different polar components of Stemona tuberosa Lour.

由表2可得，與空白對照組比較，生品乙酸乙酯部位、炙品70%乙醇提取物、炙品石油醚部位、炙品乙酸乙酯部位的酚紅排泌量均具有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)；表明該給藥組具有一定的化痰作用，并以蜜炙品作用較好。其中，蜜炙品乙酸乙酯部位作用較強(qiáng)(P<0.01)；與氯化銨陽性對照組比較，各給藥組均具有極顯著性差異(P<0.01)，結(jié)果表明對葉百部化痰作用不夠強(qiáng)。

3 結(jié)論與討論

通過對葉百部蜜炙前后止咳化痰作用及有效部位篩選，根據(jù)氨水引咳試驗(yàn)，以咳嗽潛伏期為評價指標(biāo)，除炙品水部位除外，與空白對照組比較，各給藥組具有極顯著性差異(P<0.01)，表明對葉百部提取物及不同極性部位可延長咳嗽潛伏期，其中以蜜炙品石油醚、乙酸乙酯部位及生品石油醚部位較強(qiáng)；與陽性藥可待因比較，結(jié)果表明對葉百部提取物及不同極性部位具有良好的止咳作用，其中，蜜炙后作用較好，再結(jié)合咳嗽抑制率和止咳活性，生品和蜜炙品中石油醚部位和乙酸乙酯部位均表現(xiàn)出良好的止咳作用，且石油醚部位均強(qiáng)于乙酸乙酯部位，而水部位的止咳活性最差，該結(jié)果表明對葉百部中止咳化痰主要成分為極性小的化合物，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]，該類化合物應(yīng)該為極性小的生物堿類化合物。根據(jù)酚紅化痰試驗(yàn)，以酚紅排泌量為評價指標(biāo)，蜜炙品化痰作用較好，其中，以蜜炙品乙酸乙酯部位作用較強(qiáng)(P<0.01)，但通過和陽性藥氯化銨比較，其作用不強(qiáng)，結(jié)果表明，具有良好的止咳活性，但化痰作用不明顯，研究結(jié)論與該藥物臨床“蜜炙后偏于潤肺止咳”的應(yīng)用基本相符合。

咳嗽是呼吸系統(tǒng)疾病的主要癥狀，是一種保護(hù)性反射，長期慢性咳嗽會使肺內(nèi)壓升高，引發(fā)支氣管炎、肺結(jié)核等病證，目前臨床上鎮(zhèn)咳藥物主要通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)、減少黏液分泌等途徑[9]進(jìn)行止咳。對葉百部為臨床止咳常用藥，主治久咳不止、百日咳等，但生品有小毒，多蜜炙后使用，發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)主要是生物堿，但蜜炙后部分生物堿有含量變化[10]。根據(jù)本文研究結(jié)果，該生物堿主要是小極性類化合物，同時，對葉百部有一定化痰作用，且主要作用部位為乙酸乙酯部位，極性偏小，其發(fā)揮止咳作用的機(jī)理是否與該化痰作用有關(guān)，目前尚無研究論證，其蜜炙后減毒增效的物質(zhì)基礎(chǔ)是否與生物堿類成分及其他非生物堿類成分有關(guān)，有待進(jìn)一步的研究。