龍杰鳳，胡秀虹，周邦華，韋國(guó)蘭，王 翔，2

(1凱里學(xué)院，貴州 凱里 556011；2黔東南民族藥綜合利用工程技術(shù)研究中心，貴州 凱里 556011)

黃精為百合科(Liliaceae)黃精屬(PolygonatumMill.)多年生草本植物，其根狀莖入藥[1]。在第四次全國(guó)中藥資源普查中發(fā)現(xiàn)，貴州黔東南黃精蘊(yùn)藏量大，野生植物資源豐富，藥用價(jià)值高，黃精是2015版《中國(guó)藥典》收錄的重點(diǎn)藥材[2]，貴州苗族用其根莖主治發(fā)熱感冒咳嗽，民間藥用種類(lèi)大約有十幾種[3]；中醫(yī)常用黃精降血糖、降血脂、抗炎抗菌、延緩衰老、調(diào)節(jié)免疫力等[4]?，F(xiàn)代研究表明黃精富含黃精多糖、皂苷、黃酮、蒽醌類(lèi)等藥用成分[5-8]，Yu H S等[9]從黃精中分離鑒定了甘草素、新異甘草苷、異甘草素等多種黃酮類(lèi)成分，何蘭香等人[10]用酶法-超聲提取黃酮的最佳提取條件：纖維素酶的用量為0.75%，乙醇濃度為40%，液料比為20∶1，超聲時(shí)間30 min，總黃酮含量為1.595%；雖然貴州黔東南的黃精蘊(yùn)藏量大且藥用歷史悠久，但是對(duì)該藥材藥用成分及提取工藝研究尚不充分，黔東南黃精總黃酮的超聲提取及含量測(cè)定未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，基于黔東南豐富的黃精野生資源及黃酮的重要作用，對(duì)其提取工藝的研究勢(shì)在必行。本文主要對(duì)黔東南黃精中總黃酮的超聲提取工藝進(jìn)行試驗(yàn)探究，選出最佳提取工藝，測(cè)定其含量。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用黃精藥材采集于貴州省黔東南州的鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣、黃平縣、丹寨縣、黎平縣、雷公山，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)王波老師鑒定為黃精的根狀莖，黃酮對(duì)照品蘆丁采購(gòu)于成都華康生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

亞硝酸鈉、氯化鋁、無(wú)水乙醇(重慶川江化學(xué)試劑廠(chǎng))；硝酸鋁、氫氧化鈉(廣東汕頭市西隴化工廠(chǎng))；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(北京科偉永興儀器有限公司)；暗箱三用紫外線(xiàn)分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；紫外-可見(jiàn)光光譜儀2550(日本島津)；超聲儀(深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司)；循環(huán)水真空泵(上海申光儀器儀表有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 黃精藥材的處理

將黃精根狀莖洗凈切片后，置于恒溫干燥箱60 ℃保持24 h除去水分烘干，待冷卻后取出，粉碎過(guò)40目篩，備用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

精密稱(chēng)量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品50.0 mg，置于25 mL的容量瓶中，加適量乙醇溶液溶解，室溫放冷，再加乙醇定容，搖勻，再精密量取10 mL蘆丁溶液至100 mL 的容量瓶中，加水搖勻定容，得到0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。參照《中國(guó)藥典》，準(zhǔn)確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.0 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL置于10 mL的容量瓶中，分別在標(biāo)簽上寫(xiě)上1到6組，每個(gè)量瓶中加入0.4 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻，放置6 min后；加入0.4 mL 10%硝酸鋁，搖勻，放置6 min，最后加入4 mL 40%氫氧化鈉，加水定容至刻度，搖勻，放置15 min。

2.3 樣品的提取制備

稱(chēng)定黃精粉末2.0 g置入圓底燒瓶中，加入60%乙醇，料液比1∶10，溫度50 ℃ ，保鮮膜封口，超聲時(shí)間25 min，經(jīng)冷卻、過(guò)濾、收集濾液，作為樣品溶液。

2.4 黃酮薄層色譜的制備

取硅膠G薄層板在120 ℃活化2 h，冷卻待用，黃精提取液為供試液，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液為對(duì)照液，以V(三氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶1為展開(kāi)劑，在紫外光燈365 nm下檢視。

2.5 紫外波長(zhǎng)的選擇

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液在紫外分光光度儀(島津UV-2550)下進(jìn)行3次光譜測(cè)定，均在512 nm處出現(xiàn)最大吸收峰。

2.6 提取工藝設(shè)計(jì)

用超聲輔助提取法，對(duì)黃酮提取的影響因素主要有以下4種：提取溫度、料液比、體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，考察4種因素的影響。首先實(shí)驗(yàn)設(shè)定提取溶劑為無(wú)水乙醇，提取溫度為60 ℃，提取時(shí)間為1 h，料液比為1∶10，溶劑體積分?jǐn)?shù)60%，改變其中的某一個(gè)因素，固定其他因素。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、線(xiàn)性關(guān)系與薄層色譜

3.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

以蘆丁的吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖1)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品各濃度的吸光度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，在512 nm處蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程為y=56.686x-0.0018，R2=0.9996。結(jié)果表明，在0.002～0.010 mg/mL的范圍內(nèi)，吸光度與總黃酮濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，見(jiàn)圖1。

表1 512nm處蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品各含量的吸光度測(cè)定結(jié)果Tab.1 Absorbance determination results ofstandard rutin at 512 nm

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Rutin standard curve

3.1.2 薄層色譜結(jié)果

分別用毛細(xì)管蘸取對(duì)照品與供試品樣品液各10 mL，點(diǎn)樣于在120 ℃活化2 h的硅膠G薄層板，點(diǎn)樣編號(hào)為1至6，其中1、2為對(duì)照品，3、4、5、6為供試品，以V(三氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶1為展開(kāi)劑，展開(kāi)約至8 cm時(shí)取出，用吹風(fēng)機(jī)吹干，噴三氯化鋁試液，吹干，在紫外光燈365 nm下檢視，可以看見(jiàn)對(duì)照品與供試品在相應(yīng)的位置下顯示相同的黃綠色斑點(diǎn)，但供試品黃綠色斑點(diǎn)較淡，說(shuō)明總黃酮含量較低，其結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 蘆丁薄層色譜圖Fig.2 Thin layer chromatogram of rutin

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.2.1 不同料液比對(duì)黃精總黃酮提取率的影響

精密稱(chēng)取2.0 g黃精粉末5份，在溫度60 ℃、體積分?jǐn)?shù)60%條件下提取15 min，共設(shè)置5個(gè)分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25的料液比，固定其他因素不變，計(jì)算總黃酮的含量，結(jié)果見(jiàn)表2和圖3。

表2 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響Tab.2 Effect of material liquid ratio on the extractionrate of total flavonoids

圖3 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of material liquid ratio on theextraction rate of total flavonoids

3.2.2 不同體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃精總黃酮提取率的影響

精密稱(chēng)取2.0 g黃精粉末5份，在溫度60 ℃、料液比1∶10、提取時(shí)間15 min條件下，共設(shè)置5個(gè)分別為60%、70%、80%、90%、100%的乙醇體積分?jǐn)?shù)，固定其他因素不變，計(jì)算總黃酮的提取率，結(jié)果見(jiàn)表3和圖4。

表3 體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響Tab.3 Effect of volume fraction on the extractionrate of total flavonoids

圖4 體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of volume fraction on the extractionrate of total flavonoids

3.2.3 不同超聲提取時(shí)間對(duì)黃精總黃酮提取率的影響

精密稱(chēng)取2.0 g黃精粉末5份，在溫度60 ℃、料液比1∶10、體積分?jǐn)?shù)60%的條件下，分別提取15 min、30 min、45 min、60 min、75 min，固定其他因素不變。計(jì)算總黃酮的提取率，結(jié)果見(jiàn)表4和圖5。

表4 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Tab.4 Effect of ultrasonic time on the extractionrate of total flavonoids

圖5 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the extractionrate of total flavonoids

3.2.4 不同提取溫度對(duì)黃精總黃酮提取率的影響

分別精密稱(chēng)取2.0 g黃精粉末5份，在料液比為1∶10、體積分?jǐn)?shù)60%、提取時(shí)間15 min條件下，分別設(shè)定提取溫度為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃，固定其他因素不變。計(jì)算總黃酮的提取率，結(jié)果見(jiàn)表5和圖6。

表5 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Tab.5 Effect of extraction temperature on the extractionrate of total flavonoids

圖6 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on theextraction rate of total flavonoids

3.3 黃精總黃酮提取工藝的正交試驗(yàn)

由上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，對(duì)每一個(gè)實(shí)驗(yàn)變量選定3個(gè)水平4個(gè)因素，進(jìn)一步探討在相近的實(shí)驗(yàn)條件下更加精準(zhǔn)的控制實(shí)驗(yàn)變量，以求最佳得率，優(yōu)選最優(yōu)工藝，即水平與因素表見(jiàn)表6。

表6 水平與因素表Tab.6 Table of levels and factors

根據(jù)上述所設(shè)計(jì)的因素水平，設(shè)計(jì)以L(fǎng)9(34)為正交試驗(yàn)方案提取黃精總黃酮，且每組實(shí)驗(yàn)都在相同的條件下重復(fù)3次提取，操作步驟與單因素實(shí)驗(yàn)步驟一樣，優(yōu)選出黃精總黃酮提取工藝的優(yōu)化條件，其正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Results of L9(34) orthogonal test

根據(jù)正交試驗(yàn)表R值可知，影響黃精總黃酮提取率的因素強(qiáng)度為：料液比(D)>提取溫度(A)>體積分?jǐn)?shù)(C)>提取時(shí)間(B)，故以超聲波提取黃精總黃酮最佳的提取工藝為A2B2C3D1，即提取溫度70 ℃、超聲時(shí)間45 min、乙醇濃度80%、料液比1∶5，則總黃酮的提取率為1.23%，含量為2.46 mg/g。

3.4 正交試驗(yàn)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照優(yōu)化得到的提取工藝，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的均值含量均高于正交實(shí)驗(yàn)表中的各個(gè)實(shí)驗(yàn)號(hào)，說(shuō)明提取工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好。見(jiàn)表8。

表8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.8 Verification of experimental results

3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)

取正交實(shí)驗(yàn)A2B2C3D1所得的供試品溶液，分別在0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h測(cè)定其濃度與吸光度，計(jì)算RSD=0.97%，其結(jié)果表明供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)研究利用超聲波法從黃精中提取總黃酮化合物的工藝，考察了提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、體積分?jǐn)?shù)(C)、料液比(D)4個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的影響，并通過(guò)正交試驗(yàn)得出最佳工藝。結(jié)果表明，4個(gè)因素對(duì)黃精總黃酮得率的影響強(qiáng)度為D>A>C>B，最佳工藝以料液比為1∶5、提取溫度為70 ℃、乙醇濃度為80%、提取時(shí)間為45 min，此時(shí)總黃酮含量為2.46 mg/g。