裴冬，閔瑋

（蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，蘇州 215000）

人們對皮膚健康的迫切需求， 使得皮膚光老化的防治日益成為皮膚科學(xué)新興的研究方向。 長波紫外線（UVA，320-400nm）因為能夠穿透表皮層直達(dá)真皮層， 直接損傷人成纖維細(xì)胞（human fibroblasts，HFs）,是日光致皮膚老化最相關(guān)的成分[1]。UVA 可通過不同的信號通路引起皮膚細(xì)胞發(fā)生光老化[2-4]。 EGCG（epigallocatechin gallate，表沒食子兒茶素沒食子酸酯）是綠茶茶多酚的主要成份，因其抗氧化等功效為大眾熟知， 自然界很多草本植物中富含該物質(zhì)。 之前的研究發(fā)現(xiàn)EGCG 能夠有效減少皮膚細(xì)胞因太陽輻射引起的氧化損傷和光產(chǎn)物形成[5-7]。 本研究將通過檢測HFs 在EGCG和UVA 影響下細(xì)胞周期及相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)變化， 初步揭示EGCG 抗光老化和細(xì)胞機(jī)制的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑 日光紫外線UVA 模擬器(上海 Sigma 公司)， 流式細(xì)胞儀 （美國 EPICS 公司），ABI7300 實時定量 PCR 儀 （美國生物應(yīng)用技術(shù)公司），EGCG（中國藥品生物制品檢定所）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和UVA 照射 收集本院急診外科手術(shù)室青少年包皮術(shù)后皮膚， 酶消化法分離HFs，在 37℃、5% CO2條件下， 用含 10%FBS 的 DMEM培養(yǎng)。0.25%胰酶和0.02% EDTA 消化傳代，調(diào)整濃度至1×106/ml，定量接種于培養(yǎng)皿中。

細(xì)胞生長至亞融合狀態(tài)時分為四組：Ⅰ組為空白對照組，Ⅱ組為EGCG 組，Ⅲ組為UVA 組，Ⅳ組為UVA+EGCG 組， 第Ⅳ組中EGCG 在照光前 2h和照光后加入，使之達(dá)到 25μg/ml。 用 UVA 模擬器對置于PBS 里的Ⅲ、 Ⅳ組細(xì)胞進(jìn)行照射， 劑量設(shè)置：10J/cm2。24h 后收集細(xì)胞，流式檢測需要的細(xì)胞光照后72h 收集。 每組3 個復(fù)孔，重復(fù)實驗3 次。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 收集的細(xì)胞用75%乙醇固定。 PBS 洗3 次，加入4℃保存的含50 mg/L Triton 的碘化丙啶（PI）常溫避光 0.5h，200 目濾網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測。

1.2.3 real -time PCR 檢 測 p53、p16 和 c -myc mRNA 表達(dá) 操作嚴(yán)格遵循試劑說明書， 細(xì)胞總RNA 用 Trizol 試劑提取，-80℃冰箱凍存。 cDNA 合成 反 應(yīng) 體 系 為 10μl：MgCl2（25mM） 2μl，10 ×RTBuffer 1μl，RNase Free dH2O 3.75μl，dNTP Mixture（10 mM） 1μl，PRNase Inhibitor ( 40U/μl) 0.25μl，AMV Reverse Transcriptase （5U/μl） 0.5μl，Oligo dT-Adaptor Primer（2.5 pmol/μl） 0.5μl，實驗樣品 RNA 1μl。 反應(yīng)條件為：42℃ 1h→99℃ 15 min→5℃ 5min。 -80℃凍存逆轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 備用。

PCR 擴(kuò)增：p53 引物序列，上游引物 5’- TGCC CAACAACACCAGCTC-3’， 下游引物 5’- CCAAG GCCTCATTCAGCTCTC-3’；p16 引物序列，上游引物 5’- CTGCTTACGAATTTGCCGAC-3’，下游引物5’-GCAGCATCGATATGCTTCAC -3’；c-myc 引物序列,上游引物 5’- AGGCTATTCTGCCCATTT -3’,下游引物 5’- TCGTAGTCGAGGTCATAGTTC-3’。實時定量PCR 檢測mRNA 表達(dá)，PCR 反應(yīng)體系共20μl: 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2μl，2×QuantiTect SYBR Green I RT-PCR Master Mix 10μl；上游引物、下游引物（10 μmol/μl）各 0.5μl,終濃度為 0.15mol/μl；QuantiTect RT Mix 0.2μl； 無 DNAase 水 6.8μl。 反應(yīng)條件為:95℃ 10min （1 Cycle），94℃ 15s→59℃ 20s →72℃30s（45 Cycle）測定吸光值。 相對含量% = 2–ΔΔCT，ΔΔCT=ΔCT處理組-ΔCT對照組。

1.2.4 統(tǒng)計分析 以SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行組間單因素方差分析（One-Way ANOVA），當(dāng)P＜0.05 時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGCG 對UVA 輻射后HFs G1 期細(xì)胞比率的改變 UVA 輻射致使細(xì)胞周期阻滯，是細(xì)胞損傷正常的反應(yīng)機(jī)制， 然而長久的阻滯會不可避免引起細(xì)胞衰老。 實驗結(jié)果表明，光照后 24h、72h，G1 期的細(xì)胞從空白組的59.94%分別增加到81.04%、89.09%，發(fā)生明顯的 G1 期阻滯（P＜0.05）。而在照光后24h，EGCG 共孵育組的 G1 期 HFs 百分比為 75.32%，比 UVA 組明顯減少（P＜0.05）。 證明 EGCG 確實能夠減少UVA 導(dǎo)致的G1 期阻滯（見圖1）。

圖1 EGCG 和UVA 對細(xì)胞周期的影響

2.2 EGCG 對 UVA 輻射后 HFs p53、p16 和 c-myc mRNA 表達(dá)水平變化的影響 EGCG 組p53 和p16 mRNA 表達(dá)較第Ⅰ組不明顯（P＞0.05）；而 UVA 照射后， 它們的表達(dá)水平顯著增加 （P＜0.05）；UVA+EGCG 組p53 和p16 mRNA 表達(dá)水平較僅照光組顯著降低（P＜0.05）。 另外，單純 EGCG 處理使 cmyc mRNA 表達(dá)水平下降 （P＜0.05），UVA 照射使c-myc mRNA 表達(dá)水平降低幅度更?。≒＜0.05），加入EGCG 干預(yù)可使c-myc 表達(dá)較照光組輕度降低，但差異不明顯（P＞0.05）（見圖 2）。

3 討論

細(xì)胞衰老有很多生物學(xué)表現(xiàn)， 可以通過很多方法檢測，周期停滯是其中一個重要的特征。 本研究通過細(xì)胞周期來檢測細(xì)胞的老化，并選擇EGCG這一已被廣泛證實的具有多種生物功效、 易于獲取的成份來對HFs 的老化進(jìn)行干預(yù),觀察其效應(yīng)并探討其可能的機(jī)制。 細(xì)胞內(nèi)外各種信號可誘導(dǎo)周期停滯,而周期停滯信號的增加又可以誘導(dǎo)增殖細(xì)胞的衰老[8,9]。 本實驗中 HFs 受到 10J/cm2UVA 輻射后發(fā)生顯著G1 期阻滯， 從對照組的59.94%提升到81.04%，而EGCG+UVA 共處理后G1 期細(xì)胞比率僅為75.32%。 證明EGCG 能夠顯著減輕UVA導(dǎo)致的細(xì)胞周期阻滯， 抑制UVA 引起的細(xì)胞衰老，其機(jī)制可能與其抗細(xì)胞DNA 氧化損傷功能相關(guān)。

圖 2 EGCG 和 UVA 照射對 p53、p16和c-myc mRNA 表達(dá)水平的影響

研究證實p53 在誘發(fā)細(xì)胞周期阻滯、 增殖性衰老及凋亡的信號通路中起著至關(guān)重要的作用[10]。p16 則參與直接調(diào)控細(xì)胞周期、負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分裂，P16 蛋白通過抑制CDK4 干擾G1-S 轉(zhuǎn)換[11-13]。 實驗結(jié)果表明，光照明顯促進(jìn)細(xì)胞阻滯，并使p53 和p16 mRNA 升高，可能是通過基因途徑促進(jìn)了老化的發(fā)生； 而EGCG 共處理則減少了這種變化，可能與EGCG 抗腫瘤、促進(jìn)老化細(xì)胞凋亡作用有關(guān)。 此外，c-myc 基因是一種促分裂、縮周期、讓細(xì)胞不停增殖的基因，與腫瘤密切相關(guān)[14,15]。 實驗中UVA 使c-myc mRNA 表達(dá)水平降低，影響細(xì)胞分裂， 與UVA 能夠增加細(xì)胞周期阻滯相一致；而腫瘤細(xì)胞最顯著的特點之一就是分裂加快、 不斷增殖，UVA 抑制c-myc 引起的上述改變， 即抑制c-myc 途徑可能引起的HFs 發(fā)生癌變， 提示衰老或許是細(xì)胞自身阻止瘤變的主動防護(hù)機(jī)制。 單純EGCG 及輻射前后加藥干預(yù)降低c-myc 表達(dá)，這也許是因為其熟知的抗腫瘤功能。 當(dāng)UVA+EGCG 共同作用于細(xì)胞時， 可能UVA 引起的細(xì)胞衰老及EGCG 的抗腫瘤功能相互協(xié)同，使c-myc 表達(dá)進(jìn)一步下降。 紫外線長期過量的照射引起的細(xì)胞癌變有可能是因為損傷的累積促使量變轉(zhuǎn)化為質(zhì)變。

總之，EGCG 能夠明顯減少UVA 誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯，證明其具有對抗光輻射老化的作用，機(jī)制可能涉及p53、p16 和c-myc 等老化相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控。