鄭若愚，孫安然，楊光友

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2.四川省自貢市大安區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 自貢 643010）

黃艾美耳球蟲是寄生在家兔小腸后部、盲腸及結(jié)腸部的強(qiáng)致病性腸道球蟲，能引起宿主生長發(fā)育受阻甚至死亡，對(duì)養(yǎng)兔業(yè)危害極大。

1 病原形態(tài)

黃艾美耳球蟲卵囊似倒梨形，前端較后端鈍，前半部寬于后半部。囊壁為兩層，外層較厚且顏色淺，胚孔內(nèi)陷，卵囊壁在胚孔周圍增厚，無卵囊殘?bào)w。

卵囊大小存在蟲株差異，河北株黃艾美耳球蟲卵囊大小為（2535）×（18～24）μm，平均大小為30～21 μm；河南 株卵囊大小是（22.5～35）×（19.8～26.3）μm，平均30.9～22.2 μm。

2 生活史

黃艾美耳球蟲發(fā)育階段由裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖三部分組成。

2.1 裂殖生殖 早期學(xué)者以裂殖體形狀大小為依據(jù)，運(yùn)用光鏡技術(shù)將裂殖生殖分為5代，其第2代裂殖體稀疏分布，而第3代裂殖體成團(tuán)分布，第4代裂殖體則形狀細(xì)長。用電鏡技術(shù)同樣可觀察區(qū)分出5代裂殖生殖。有學(xué)者以裂殖體的寄生部位為依據(jù)將黃艾美耳球蟲劃分為4 代，第1 代裂殖體于感染后60～72 h出現(xiàn)于小腸腺上皮，第2、3、4代裂殖體于感染后84、96、144 h出現(xiàn)在盲腸、結(jié)腸的腺上皮、黏膜上皮和腺上皮。

根據(jù)裂殖體的數(shù)量和形態(tài)大小，可將裂殖體劃分為細(xì)型和粗型2種。有研究提到感染黃艾美耳球蟲108 h后，觀察到一種小型裂殖體，其接近于之前所劃分的粗型裂殖體。若用電鏡觀察，也將裂殖體分為A型（細(xì)型）和B型（粗形）。

2.2 配子生殖 黃艾美耳球蟲第4 代裂殖子侵入新的寄主細(xì)胞或原寄生細(xì)胞中開始有性生殖。

第4代裂殖子發(fā)育為滋養(yǎng)體。滋養(yǎng)體一部分發(fā)育為小配子體，另一部分發(fā)育為大配子體。二者區(qū)別在于前者核小，核仁不明顯，而后者核大，核仁明顯。

2.2.1 小配子體發(fā)育 小配子體發(fā)育過程分為小配子體生長階段和小配子體分化階段。

在小配子體生長階段，通過內(nèi)部產(chǎn)生大量裂痕，使得小配子體表面積增大，且通過本質(zhì)為有絲分裂的核分裂產(chǎn)生越來越多的紫色核，變?yōu)槎嗪梭w。隨后，產(chǎn)生的核逐步向周邊的限制膜移動(dòng)，細(xì)胞中央已無細(xì)胞核。

核分裂完成后，進(jìn)入到小配子體分化階段，在電鏡下觀察到小配子體分化順序是：核上方出現(xiàn)兩個(gè)中心粒，中心粒轉(zhuǎn)化為基粒，兩根鞭毛分別從基粒長出，其長出部位呈球形、隆起。隨著鞭毛的長出，小配子體的核被分為兩個(gè)部分，包括含濃染色質(zhì)的濃染部和含染色質(zhì)較少的淡染部。最后核被拉長分離，濃染部成為小配子的體部，淡染部作為核留在母體。同時(shí)隆起部位拉長形成頂體，至此小配子發(fā)育成熟，分化完成。

黃艾美耳球蟲小配子體有典型的微孔存在，這是蟲體吸收營養(yǎng)和排泄廢物的途徑。小配子體的發(fā)育過程始終在帶蟲空泡內(nèi)進(jìn)行。帶蟲空泡是內(nèi)含基質(zhì)、不定形物質(zhì)與豐富泡內(nèi)小管的發(fā)達(dá)單層膜體。小配子體分化完成后分散于各發(fā)達(dá)的泡內(nèi)小管間。泡內(nèi)小管可能也是蟲體獲取營養(yǎng)的另一途徑。

2.2.2 大配子體發(fā)育過程 早期大配子為球形，直徑為52 μm，成熟的大配子體大小為（23～23.9）μm×（23.7～24.4）μm，平均23.4 μm×24 μm。大配子體被單層膜，中央有一深紅色核，核中央有一核仁。

隨著大配子體的逐漸發(fā)育，胞質(zhì)中出現(xiàn)成囊顆粒前體，這些顆粒起初形狀不規(guī)則，較為分散，隨后逐漸向限制膜移動(dòng)，移動(dòng)過程中體積增大，致密度增強(qiáng)，成為成囊顆粒Ⅱ（WFBⅡ）與成囊顆粒Ⅰ（WFBⅠ）。

WFBⅠ形成較晚，分布于WFBⅡ的外側(cè)。大配子體發(fā)育成熟的標(biāo)志是WFBⅠ與WFBⅡ逐步向細(xì)胞周邊移動(dòng)，WFBⅠ先到達(dá)限制膜內(nèi)側(cè)，隨后WFBⅡ移動(dòng)至WFBⅠ內(nèi)側(cè)，二者聚集整齊排列于限制膜內(nèi)層。至此大配子體發(fā)育成熟。

2.3 卵囊形成 小配子成熟后從小配子體游出，與發(fā)育成熟的大配子結(jié)合為合子，大小合子結(jié)合后，卵囊壁開始形成。

一般認(rèn)為盲腸基部、圓小囊、蚓突，結(jié)腸均為卵囊形成的部位，其中盲腸基部是卵囊形成的主要部位。兔感染黃艾美耳球蟲后發(fā)病潛隱期為8～9d，卵囊排出高峰期為10～11 d。

3 致病性

黃艾美耳球蟲屬高致病性腸道球蟲，主要寄生于兔的空腸、回腸、盲腸近端和結(jié)腸的絨毛和腺上皮細(xì)胞中，配子體主要破壞盲腸黏膜的隱窩細(xì)胞。

感染兔空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸均有病變，其中盲腸病變最嚴(yán)重，幾乎所有的腸腺細(xì)胞均出現(xiàn)大配子或卵囊寄生，這是因?yàn)樵撉蛳x的配子生殖主要發(fā)生于盲腸的腸腺上皮細(xì)胞。腸道杯狀細(xì)胞分泌旺盛，使得腸黏膜表面被覆假膜，腸絨毛也均出現(xiàn)萎縮、腫脹等。

使用高劑量卵囊感染19日齡前的哺乳仔兔，少數(shù)實(shí)驗(yàn)兔排出少量卵囊，大部分實(shí)驗(yàn)兔不排出卵囊。同劑量感染22日齡以后的仔兔，則大量兔排出卵囊，且卵囊數(shù)量在一定范圍內(nèi)與感染兔的日齡呈正相關(guān)。19 日齡前的哺乳仔兔主要由母乳喂養(yǎng)，仔兔可通過母乳獲得母源抗體，對(duì)球蟲有一定的抗性，另外子孢子順利實(shí)施黏附和入侵需要對(duì)氨基苯甲酸發(fā)揮重要作用，而母乳中缺乏該物質(zhì)，故球蟲此期無法有效進(jìn)行內(nèi)生性發(fā)育。

當(dāng)使用較大的感染劑量（3～5×107）時(shí)，實(shí)驗(yàn)兔的盲腸、結(jié)腸均嚴(yán)重受損，而使用1×103的感染劑量，實(shí)驗(yàn)兔的臨床癥狀較輕，使用2×103卵囊接種，實(shí)驗(yàn)兔出現(xiàn)臨床癥狀，但不致死。

4 流行病學(xué)

兔球蟲病一年四季皆可發(fā)生，尤其在溫暖多雨的季節(jié)。不同地區(qū)的流行優(yōu)勢種有一定差異，但不同品種、年齡的兔對(duì)艾美耳球蟲都易感，尤其是斷奶至4月齡的幼兔，其感染率和死亡率均處于較高水平。

5 卵囊分子檢測

5.1 常規(guī)PCR 以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測兔球蟲，其檢測標(biāo)識(shí)有：18S rDNA、ITS-1、ITS-2和ITS全序列。

2011 年根據(jù)GenBank 中發(fā)表的黃艾美耳球蟲18S rDNA設(shè)計(jì)引物，建立PCR方法，對(duì)黃艾美耳球蟲河北株蟲種進(jìn)行rDNA 擴(kuò)增，結(jié)果出現(xiàn)大小為1 465 bp 的清晰條帶，與GenBank 中公布的EF694011 的相似性達(dá)99.6%。隨后又有學(xué)者通過PCR 方法擴(kuò)增ITS-1 片段，得到455 bp 大小的條帶，與GenBank 中發(fā)布的黃艾美耳球蟲ITS-1序列相似性為97.9%。

2017 年根據(jù)GenBank 中發(fā)表的艾美耳屬球蟲保守序列設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)特異性引物鑒定黃艾美耳球蟲，得到黃艾美耳球蟲ITS1序列長330 bp，5.8S rDNA序列長157 bp，ITS2序列長522 bp。該方法經(jīng)過電泳檢測，結(jié)果表明與大型艾美耳球蟲和腸艾美耳球蟲無交叉反應(yīng)，證明ITS 序列是可靠的球蟲特異性檢測標(biāo)識(shí)。

5.2 套式PCR 2011 年，Oliveira 通過PCR 擴(kuò)增11 種艾美耳球蟲各自的rDNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（ITS-1）序列，建立了包含黃艾美耳球蟲在內(nèi)的11種艾美耳球蟲的檢測方法，其檢測限度最低可達(dá)到0.8～1.7 個(gè)孢子化卵囊，敏感性高，特異性好。

5.3 多重PCR 國外學(xué)者基于6 個(gè)兔種艾美耳球蟲的ITS1-5.8S rRNA-ITS2 完整序列，建立起檢測包含黃艾美耳球蟲在內(nèi)的三種高致病性蟲種的多重PCR 診斷方法。也有針對(duì)黃艾美耳球蟲ITS1 基因的非保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物作為分子標(biāo)識(shí)（267 bp），建立了一種多重PCR聯(lián)檢方法，可對(duì)11 種兔源艾美耳球蟲做出鑒別診斷。該方法對(duì)檢測目標(biāo)表現(xiàn)出了高敏感性和高特異性。

6 免疫學(xué)

6.1 免疫應(yīng)答 黃艾美耳球蟲免疫原性相對(duì)較弱，與腸艾美耳球蟲有著相似的免疫應(yīng)答。

實(shí)驗(yàn)觀察表明，在感染了黃艾美耳球蟲的第19 d，CD8+T細(xì)胞比例在腸系膜淋巴結(jié)等部位出現(xiàn)明顯增高，CD4+T細(xì)胞比例也有增高，但幅度較CD8+T低；感染后19～33 d，脾臟中的CD4+T細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞比例并無明顯增高、降低，可以得出：腸道淋巴組織是兔黃艾美耳球蟲免疫應(yīng)答發(fā)生的主要位置。

6.2 活蟲苗研究 在兔黃艾美耳球蟲活蟲苗的實(shí)驗(yàn)中，研究者建立不同的免疫程序：a 組均等中劑量，免疫3 次，2 000 個(gè)卵囊/只·次；b 組均等低劑量免疫，免疫5 次，200 個(gè)卵囊/只·次；c 組加倍遞增劑量免疫，免疫5 次，起始劑量200 個(gè)卵囊/只·次，每次增加一倍攻蟲量。

實(shí)驗(yàn)對(duì)兔的臨床癥狀、體重變化、卵囊排出量、腸黏膜病理變化、IgG效價(jià)等指標(biāo)進(jìn)行比較。

在免疫過程中，出現(xiàn)腹瀉、精神沉郁等臨床癥狀的a 組情況最重，b、c 組次之，同時(shí)兔腸道出現(xiàn)病理變化，如小腸腸絨毛萎縮、腫脹，腸道杯狀細(xì)胞分泌旺盛，見大量分泌物。b組病變最嚴(yán)重，a、c組次之。

結(jié)合兔的卵囊排出量和增重情況等指標(biāo)，表明c組獲得了較好的免疫保護(hù)。綜合以上結(jié)果表明，小劑量加倍遞增免疫的效果最優(yōu)。該結(jié)果與使用1×10-6殺蟲靈拌料飼喂的免疫結(jié)果相似。

6.3 早熟株選育 研究人員在SPF 兔上進(jìn)行了連續(xù)10個(gè)世代的早熟壓力選育，獲得了穩(wěn)定的早熟株，其與正常株對(duì)比，潛隱期從201 h 縮短至139.5 h。再進(jìn)行了五代篩選，證明了該早熟株的穩(wěn)定性。該早熟株在內(nèi)生發(fā)育部分與正常株存在差異，其缺少第3、4代裂殖生殖，相對(duì)正常株的5代裂殖生殖，早熟株只有3代。

7 藥物防治

目前主要采用在飲水或飼料中加入抗球蟲藥的方式預(yù)防兔球蟲病。對(duì)兔球蟲病有預(yù)防作用的藥物有氯苯胍、地克珠利和氯羥吡啶等。有治療作用的藥物有磺胺類，如磺胺二甲氧嘧啶等?；瘜W(xué)藥物需有計(jì)劃、合理地輪換使用。

黃艾美耳球蟲是兔球蟲中的強(qiáng)致病性蟲株，免疫原性相對(duì)較弱。防治兔球蟲的主要措施仍然是用藥，但球蟲耐藥情況日漸嚴(yán)重，故推進(jìn)兔球蟲疫苗的研究顯得日趨重要。