安 琪，季雯珺，何永剛，章志宏

（武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（武漢大學(xué)），武漢 430072）

水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的糧食作物之一，養(yǎng)活了全球一半以上的人口。水稻產(chǎn)量的構(gòu)成因素包括單位面積有效穗數(shù)、每穗穎花數(shù)、千粒重和結(jié)實(shí)率等［1］。而水稻分蘗直接決定有效穗數(shù)，并對(duì)每穗穎花數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重有重要影響。

水稻分蘗的形成過程主要包括分蘗芽的形成與分蘗芽的伸長(zhǎng)［2-4］。在每個(gè)葉位的葉腋里一般都能形成一個(gè)腋芽，也叫分蘗芽，分蘗芽能夠進(jìn)一步伸長(zhǎng)生長(zhǎng)形成分蘗。影響水稻成芽、成蘗的因素包括環(huán)境因素和遺傳因素。環(huán)境因素包括光、溫、水、肥等［5，6］。有研究表明，水稻分蘗芽在三幼一基期對(duì)環(huán)境最為敏感［7］。氮素是植物生長(zhǎng)所必需的大量元素之一，也是決定植物生物量和作物產(chǎn)量的主要限制因素［8，9］。在水稻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，充足的氮素供應(yīng)可以促進(jìn)分蘗［10］，氮供應(yīng)不足會(huì)導(dǎo)致有效分蘗數(shù)大量減少［11］。遺傳因素包括調(diào)控腋芽形成和調(diào)節(jié)分蘗芽伸長(zhǎng)的基因、植物激素、碳/氮同化相關(guān)基因等。影響腋生分生組織分化形成腋芽的基因有TE/TAD1、MOC1、MOC3、LAX1 等。 水 稻TILLERS ABSENT1（TAB1）與擬南芥WUSCHEL（WUS）基因同源，參與腋生分生組織的發(fā)育起始［12］。MOC1（monoculm1）是第一個(gè)被確認(rèn)為控制水稻分蘗的基因，該基因突變體的葉腋處不能形成分蘗芽，在成熟期只有一個(gè)主莖稈［2］。單蘗突變體MOC3（monoculm3），由于一個(gè)點(diǎn)突變而導(dǎo)致TAB1 基因的提前終止，從而妨礙了分蘗芽的形成。TE/TAD1 通過調(diào)控MOC1 的降解來調(diào)控水稻分蘗。TAD1 編碼含有細(xì)胞分裂后期促進(jìn)復(fù)合體/細(xì)胞周期體（APC/C）和多亞基E3 連接酶的一個(gè)共激活蛋白，同APC/C 復(fù)合體的亞基CDC27 直接相互作用［13，14］。TE 與MOC1 在葉腋中共表達(dá)，真核生物中功能高度保守的E3 泛素連接酶APC/C 與TE 形成復(fù)合體APC/CTE，通過26S 蛋白酶體泛素化降解MOC1［13，14］，從而使水稻分生組織特異性基因homeobox1 的表達(dá)下調(diào)，抑制腋生分生組織的起始與形成［13］。APC/CTE能夠保守性地降解細(xì)胞周期中的關(guān)鍵調(diào)控因子，從而特異性地調(diào)控分蘗發(fā)生，影響水稻株型和子粒產(chǎn)量［13，15］。

SLs 信號(hào)通路在植物分蘗形成中具有重要的調(diào)控作用，其中涉及到的基因包括SLs 合成途徑的基因D27、D17、D10 和SL 信號(hào)傳導(dǎo)的基因D14、D3、D53。如水稻的D10（DWARF10）與擬南芥的MAX4是直系同源基因，編碼一個(gè)類胡蘿卜素裂解雙加氧酶，參與SL/SLs 的生物合成，控制水稻側(cè)芽向外生長(zhǎng)［16］。 HTD1（HIGH-TILLERING DWARF1）/D17 編碼水稻中類胡蘿卜素裂解雙加氧酶OsCCD7，在類胡蘿卜素衍生物的合成中發(fā)揮作用，負(fù)調(diào)控水稻側(cè)芽生長(zhǎng)［17］。突變體d27 中生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸能力增強(qiáng)，表現(xiàn)出分蘗增加和株高變矮的表型。D3 通過控制分蘗芽的休眠性從而抑制分蘗芽的活性。d3突變體中有觀察到對(duì)于下胚軸的生長(zhǎng)缺陷，因此D3可能調(diào)控多個(gè)發(fā)育階段中不同蛋白質(zhì)的降解過程，也對(duì)分蘗階段進(jìn)行調(diào)控［18］。HTD2/D14/D88 編碼一個(gè)α/β 折疊水解酶超家族的蛋白，抑制水稻分蘗的發(fā)生，負(fù)調(diào)控水稻分蘗數(shù)［19-21］。HTD2 的突變不影響分蘗芽的形成，但對(duì)隨后分蘗芽的向外伸長(zhǎng)生長(zhǎng)有影響，導(dǎo)致分蘗增加、植株矮化的表型［19］。IPA1/OsSPL14 作為SPL 基因家族的一員，起著轉(zhuǎn)錄因子的作用，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，IPA1 控制水稻分蘗；在生殖生長(zhǎng)階段，IPA1 的高表達(dá)促進(jìn)了穗分枝。IPA1 能與一些基因的啟動(dòng)子直接結(jié)合，如直接正向調(diào)控水稻株型的重要基因DEP1 以及負(fù)向調(diào)控水稻分蘗芽生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因OsTB1，進(jìn)而分別抑制水稻分蘗發(fā)生和調(diào)節(jié)水稻穗長(zhǎng)和株高［22］。

調(diào)控水稻分蘗的激素包括生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和獨(dú)角金內(nèi)酯等。生長(zhǎng)素和獨(dú)角金內(nèi)酯抑制分蘗芽的生長(zhǎng)發(fā)育［23，24］，而細(xì)胞分裂素則促進(jìn)分蘗芽的生長(zhǎng)［25］。解釋植物激素調(diào)控分蘗發(fā)生的2 個(gè)模型［26］，一個(gè)是生長(zhǎng)素第二信使模型：IAA 通過正調(diào)控SL、負(fù)調(diào)控CK 起作用，而SL 和CK 進(jìn)一步調(diào)控蘗芽伸長(zhǎng)的基因從而調(diào)控蘗芽生長(zhǎng)。另一個(gè)是生長(zhǎng)素運(yùn)輸通道模型：IAA 運(yùn)輸通道被SL 所抑制，SL 會(huì)抑制IAA 運(yùn)輸?shù)鞍譖IN，從而抑制IAA 從分蘗芽中輸出，進(jìn)而抑制腋芽的生長(zhǎng)［26］。

水稻育種和生產(chǎn)實(shí)踐表明，低節(jié)位、早發(fā)分蘗在拔節(jié)期具有與主莖媲美的生物量，在成熟期穗部性狀上更接近主莖，對(duì)植株產(chǎn)量的形成具有更大貢獻(xiàn)。目前專注于水稻低節(jié)位、早發(fā)分蘗的深入研究很少。本研究在考察水稻品種低節(jié)位、早發(fā)分蘗遺傳變異的基礎(chǔ)上，較深入地探究了水稻低節(jié)位、早發(fā)分蘗的分子遺傳基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及種植

選用具有不同分蘗特性的水稻品種天優(yōu)華占、岳4B、明恢63、揚(yáng)兩優(yōu)6 號(hào)、Y 兩優(yōu)800、中嘉早17、黃 華占、HR901、鄂早18、Basmatis、Lemont 和Star Bonnet 為材料，采用水培法培養(yǎng)水稻秧苗，營(yíng)養(yǎng)液配方為改良后的國(guó)際水稻研究所（IRRI）常規(guī)營(yíng)養(yǎng)液配方［27］。水稻種子浸種10 h、瀝水2 h，再用強(qiáng)氯精2 g 對(duì)水800 mL，浸種10～12 h，后用清水沖洗多次，于8 月18 日播種于潮濕的蛭石中，室外遮陰待種子發(fā)芽。第1 葉展開后，移至自然條件下光照培養(yǎng)，用1/4 營(yíng)養(yǎng)液澆灌，2 葉開始用1/2 營(yíng)養(yǎng)液。8月27 日選取2 葉1 心的水稻秧苗移栽到水培泡沫盤中，每穴1 苗，株、行距為6 cm×9 cm，每個(gè)品種在2 個(gè)水培盆（60 cm×36 cm×12 cm）中種植42 株。移栽后用全營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔2 d 更換一次營(yíng)養(yǎng)液，每個(gè)培養(yǎng)盆用營(yíng)養(yǎng)液10 L；5～6 葉期，每盆用營(yíng)養(yǎng)液15 L。每天用HCl 或NaOH 調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)液的pH 為5.0～5.5，并適當(dāng)補(bǔ)充揮發(fā)掉的水份。各葉齡期間隔取樣，以保證每個(gè)水稻品種相對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境一致。

1.2 水稻秧苗分蘗特性及相關(guān)農(nóng)藝性狀的觀測(cè)

在水稻秧苗培養(yǎng)過程中，每天觀察記錄分蘗發(fā)生情況。新的分蘗發(fā)生，以該分蘗的第1 片葉伸出著生葉鞘1 cm 為記錄標(biāo)準(zhǔn)。

每個(gè)水稻品種3 葉1 心至5 葉1 心時(shí)期，每個(gè)葉齡取樣5 株，測(cè)定各葉齡時(shí)期的苗高、根長(zhǎng)、各葉片的葉長(zhǎng)、葉寬、SPAD 值。隨后，對(duì)取樣材料用105 ℃殺青10 h 左右，80 ℃烘干至恒重，測(cè)定各器官及全株的干物重。

1.3 水稻秧苗生理生化指標(biāo)的測(cè)定

晴天上午10：00—11：00，每個(gè)水培盆隨機(jī)取3～4 葉期水稻秧苗5 株，選擇完全展開葉，將葉片放入液氮中保存，用于酶活性檢測(cè)；葉鞘置于牛皮紙袋中105 ℃殺青，80 ℃烘干至恒重，用于可溶性糖含量測(cè)定。

粗酶液提取及保存參考盧永恩［28］的方法，谷氨酰胺合成酶（GS）活性檢測(cè)參考Rhodes 等［29］的方法，NADH-GOGAT（谷氨酸合酶）活性測(cè)定參照Leyser［25］的方法進(jìn)行。NADH-GDH（谷氨酸脫氫酶）活性測(cè)定參照Turano 等［30］的方法進(jìn)行?？扇苄蕴堑臏y(cè)定參考張志良等［31］的《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》。

1.4 水稻秧苗基因表達(dá)的測(cè)定

晴天上午10：00—11：00 取3～4 葉期水稻秧苗，用于銨態(tài)氮同化相關(guān)酶合成基因、生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素合成基因的表達(dá)檢測(cè)；每個(gè)水培池隨機(jī)取5株，取分蘗節(jié)和芽放入液氮中保存，用于分蘗相關(guān)基因的表達(dá)檢測(cè)。

RNA 提取采用TRIzol（Invitrogen 公司）提取法；DNA 消化用DNaseⅠ購自Thermo 公司；反轉(zhuǎn)按照THUNDERBIRD SYBR?qPCR Mix QPS-201 說明書操作，試劑購自上海碩盟生物科技有限公司。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 軟件記錄整理數(shù)據(jù)，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻秧苗分蘗發(fā)生動(dòng)態(tài)

從水稻秧苗在播種后18～34 d 的分蘗發(fā)生動(dòng)態(tài)（表1）來看，12 個(gè)供試品種的分蘗特性具有較大變異。其中，天優(yōu)華占、揚(yáng)兩優(yōu)6 號(hào)、岳4B 和明恢63 4 個(gè)品種，在播種后18 d 時(shí)單株分蘗數(shù)達(dá)0.9～1.3個(gè)，隨后一直保持較高的單株分蘗數(shù)，屬于分蘗早發(fā)類型的品種。Y 兩優(yōu)800、中嘉早17、黃華占和Basmatis 4 個(gè)品種，在播種后18 d 時(shí)的單株分蘗數(shù)為0～0.2 個(gè)，但隨后快速增長(zhǎng)，單株分蘗數(shù)僅次于上述分蘗早發(fā)類型的品種，屬于蘗性居中類型的品種。HR901、鄂早18、Lemont 和Star Bonnet 4 個(gè)品種在播種后18 d 時(shí)均未發(fā)生分蘗，播種后22 d 也只有HR901 的單株分蘗數(shù)為0.1 個(gè)，此后的分蘗增長(zhǎng)一直較慢，這幾個(gè)品種屬于分蘗遲發(fā)類型的品種。從表1 顯著性分析也可以看出，播種后18～26 d，分蘗早發(fā)類型的4 個(gè)水稻品種分蘗數(shù)與其余8 個(gè)水稻品種一直都有顯著性差異。播種后22～30 d，分蘗早發(fā)類型、蘗性居中類型的水稻品種與分蘗遲發(fā)類型的水稻品種間平均分蘗數(shù)一直都有顯著性差異。

表1 水稻不同品種苗期單株分蘗數(shù)

2.2 不同水稻品種苗期第1～3 葉位成蘗率

為研究水稻早發(fā)分蘗的發(fā)生情況，本研究觀察統(tǒng)計(jì)了上述12 個(gè)水稻品種第1～3 葉位的成蘗率。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1 所示，12 個(gè)水稻品種中只有天優(yōu)華占、揚(yáng)兩優(yōu)6 號(hào)、岳4B、Y 兩優(yōu)800 在第1 葉位上長(zhǎng)出分蘗，其成蘗率分別為80%、50%、20%、10%。第2 葉位除黃華占、HR901 和鄂早18 成蘗率為0 外，其余水稻品種都形成分蘗且成蘗率都在30% 以上。天優(yōu)華占、揚(yáng)兩優(yōu)6 號(hào)、岳4B、明恢63 和Lemont 第2 葉位成蘗率為60%～100%。在第3 葉位上僅有鄂早18 的成蘗率是10%，其余水稻品種的成蘗率都在60% 以上，其中天優(yōu)華占、揚(yáng)兩優(yōu)6 號(hào)、岳4B 和明恢63 的成蘗率達(dá)100%。

2.3 水稻第1～3葉位成蘗率與分蘗數(shù)的相關(guān)性分析

圖1 水稻不同品種苗期第1～3 葉位成蘗率

為分析分蘗數(shù)與第1～3 葉位成蘗率之間的關(guān)系，本研究將12 個(gè)水稻品種1～3 葉位成蘗率分別與單株分蘗數(shù)進(jìn)行了相關(guān)性分析（表2），由表2 可知，水稻第2、3 葉位成蘗率與分蘗數(shù)呈顯著正相關(guān)，特別第2 葉位成蘗率與分蘗數(shù)之間的正相關(guān)性達(dá)極顯著水平（P＜0.01），且相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.754～0.931。水稻播種后18～34 d 的單株分蘗數(shù)與第1 葉位成蘗率之間相關(guān)性不顯著，說明第1 葉位成蘗率對(duì)單株分蘗數(shù)的影響不大。

2.4 水稻第1～3 葉位成蘗率與苗期葉片銨態(tài)氮同化酶活性、葉鞘可溶性糖含量的相關(guān)性分析

氮素水平是影響水稻分蘗發(fā)生的重要因素之一，充足的氮素供應(yīng)可以促進(jìn)分蘗［10］，供應(yīng)不足會(huì)導(dǎo)致有效分蘗數(shù)大量減少［11］。在生長(zhǎng)發(fā)育過程中水稻植株從稻田吸收無機(jī)氮的主要形式為NH4+，氮素同化酶GS、GOGAT 和GDH 在將無機(jī)氮NH4+轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮的過程中起著關(guān)鍵作用。由表3 可知，第1 葉位成蘗率與GS、NADH-GOGAT 和NADHGDH 的活性均呈顯著正相關(guān)，而第2 葉位成蘗率只與NADH-GDH 酶活性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），第3 葉位成蘗率只與NADH-GOGAT 酶活性呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。此外，表2 結(jié)果還顯示，水稻第1～3 葉位成蘗率均與秧苗葉鞘的可溶性糖含量之間的相關(guān)性不顯著。

表2 水稻第1～3 葉位成蘗率與單株分蘗數(shù)的相關(guān)性分析

2.5 水稻第1～3 葉位成蘗率與分蘗相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

由表4 可知，水稻秧苗第1 葉位成蘗率與分蘗芽發(fā)育相關(guān)基因（MOC1 和OGR1）、IAA 合成相關(guān)基因YUCCA6、CK 合成基因IPT5 以及SL 合成及調(diào)控通路相關(guān)基因（HTD1、D10、D3、D14、IPA1 和TB1）的表達(dá)量之間的相關(guān)性均不顯著，表明水稻第1 葉位成蘗率基本不受水稻分蘗芽發(fā)育和分蘗形成的遺傳調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)控。第2 和第3 葉位的成蘗率均與分蘗芽發(fā)育相關(guān)基因（MOC1 和OGR1）和CK 合成基因IPT5 的表達(dá)量之間相關(guān)性不顯著，但分別與IAA 合成相關(guān)基因YUCCA6 和SL 合成及調(diào)控通路相關(guān)的多數(shù)基因（HTD1、D10、D3、D14、IPA1 和TB1）的表達(dá)量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，表明水稻第2 和第3 葉位成蘗率不受分蘗芽發(fā)育的制約，IAA 合成和SL 合成及調(diào)控是負(fù)調(diào)控水稻第2 和第3 葉位成蘗率的主要遺傳基礎(chǔ)。

表3 水稻秧苗第1～3 葉位成蘗率與苗期葉片銨態(tài)氮同化酶活性、葉鞘可溶性糖含量的相關(guān)性分析

表4 水稻第1～3 葉位成蘗率與秧苗分蘗節(jié)分蘗相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

3 小結(jié)與討論

水稻分蘗是影響水稻產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一，受水稻植株遺傳基礎(chǔ)及其生長(zhǎng)發(fā)育環(huán)境的共同調(diào)控。不論是“超級(jí)雜交稻”“超高產(chǎn)新株型”還是“水稻理想株型”，其核心內(nèi)容都是控制水稻的無效分蘗、提高成穗率，進(jìn)而提高水稻產(chǎn)量。成穗數(shù)是水稻產(chǎn)量的重要構(gòu)成之一，而單株有效分蘗數(shù)又是決定成穗數(shù)的重要因素，過低或過高的分蘗數(shù)都會(huì)影響成穗數(shù)和成穗率，進(jìn)而影響到最終的產(chǎn)量形成［32，33］。在水稻生產(chǎn)中，人們習(xí)慣上將成穗率高和穗形較大的分蘗叫做優(yōu)勢(shì)分蘗［34］。優(yōu)勢(shì)的強(qiáng)弱一般是一級(jí)分蘗＞二級(jí)分蘗＞三級(jí)分蘗，同是一級(jí)分蘗的，其所處的節(jié)位比較低或者出生時(shí)間比較早，常常有較高的成穗率，穗形也比較大，因此生產(chǎn)上強(qiáng)調(diào)栽后早發(fā)分蘗。黃耀祥等［35］提出了水稻的“早發(fā)”概念，即早在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)前期就長(zhǎng)出較為強(qiáng)壯的分蘗，為重穗型遺傳特性的表達(dá)和孕育大穗提供了有效保證。蔣彭炎等［36］的“三高一穩(wěn)栽培法”中也提出要促進(jìn)早期分蘗的發(fā)生。在水稻生產(chǎn)中，低節(jié)位（早發(fā)）分蘗往往能夠形成有效分蘗，在成熟期其穗部性狀更接近主莖，對(duì)植株產(chǎn)量的形成具有重要貢獻(xiàn)。在小麥中，同樣也發(fā)現(xiàn)低節(jié)位分蘗穗的每穗粒數(shù)和每穗可育小穗數(shù)更多、每穗不育小穗數(shù)更少、千粒重更高，低節(jié)位分蘗（早發(fā)分蘗）比高節(jié)位分蘗（遲發(fā)分蘗）具有更高的單穗產(chǎn)量［37，38］。

本研究發(fā)現(xiàn)低節(jié)位早發(fā)分蘗特性在水稻品種資源中具有較大的遺傳變異，受到多種遺傳因素的調(diào)控，包括生長(zhǎng)素、獨(dú)腳金內(nèi)酯、可溶性糖含量以及氮同化相關(guān)酶活性等。水稻莖鞘中可溶性糖含量是決定其總莖蘗數(shù)和存活率的重要因素［39］，在本研究中發(fā)現(xiàn)葉鞘中可溶性糖與水稻第1～3 葉位成蘗率無顯著相關(guān)性，說明在水稻低節(jié)位的分蘗芽初步生長(zhǎng)階段，對(duì)可溶性糖的要求比較低，只要維持低水平的可溶性糖含量水稻就可以形成分蘗芽。生長(zhǎng)素合成相關(guān)基因的表達(dá)水平與水稻第2、3 葉位成蘗率呈極顯著相關(guān)，說明在水稻苗期分蘗節(jié)中YUCCA6 的表達(dá)是影響水稻不同品種低節(jié)位分蘗的關(guān)鍵因素之一。SLs 能夠抑制植物的分枝和側(cè)芽的生長(zhǎng)［40］，HTD1、D10 都是SLs 合成途徑上的基因，D14、D3 是SLs 信號(hào)傳導(dǎo)過程中的基因，IPA1 和TB1 是SLs 下游調(diào)控基因［18-21］，這些基因通過SLs 信號(hào)通路抑制水稻側(cè)芽向外生長(zhǎng)［41，42］。研究還發(fā)現(xiàn)低節(jié)位成蘗與SLs 信號(hào)通路及其下游調(diào)控基因IPA1 和TB1 密切相關(guān)，第2 葉位成蘗率與D10、D14、IPA1 和TB1 的相對(duì)表達(dá)量呈顯著相關(guān)，第3 葉位成蘗率與HTD1、D14 和TB1 的相對(duì)表達(dá)量呈顯著相關(guān)，第2、3 葉位成蘗率與D3 的相對(duì)表達(dá)量呈極顯著相關(guān)。說明當(dāng)腋芽處于分蘗原基狀態(tài)時(shí)，SLs 信號(hào)通路上HTD1、D10、D3 和D14 基因以及其下游基因IPA1 和TB1的表達(dá)已經(jīng)開始對(duì)苗期低節(jié)位分蘗芽的生長(zhǎng)起作用。

通過品種改良和栽培調(diào)控促進(jìn)低節(jié)位、早發(fā)分蘗是水稻高產(chǎn)的重要途徑，本研究為探究影響早發(fā)分蘗相關(guān)因素提供了更多的理論依據(jù)，但更細(xì)致的機(jī)理還需進(jìn)一步研究。