吳俊靜，萬(wàn)緒玲，黃藏宇，喬 木，武華玉，梅書(shū)棋，彭先文

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；2.江夏區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，武漢 430200）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染引起的一種危害極大的傳染性免疫抑制性疾病。PRRSV 具有嚴(yán)格的宿主和細(xì)胞嗜性，入侵宿主細(xì)胞依賴(lài)細(xì)胞特異性受體，如CD163［1］。PRRSV 只感染豬，不感染其他物種，且主要感染單核巨噬細(xì)胞系中分化完全的細(xì)胞，尤其是豬肺泡巨噬細(xì)胞（Porcine alveolar macrophages，PAM）。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究了PRRSV 的致病機(jī)制，取得了一些成果，但是PRRSV 的致病機(jī)制，尤其是其逃逸天然免疫、病毒與宿主互作等方面的分子機(jī)制還不清楚。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP，Matrix metallopeptidase）家族蛋白參與細(xì)胞外基質(zhì)在正常生理過(guò)程中的分解，如胚胎發(fā)育、繁殖和組織重塑等。基質(zhì)金屬蛋白酶14（MMP14）是MMP 蛋白大家族的膜型基質(zhì)金屬蛋白酶（MT-MMP）亞家族成員之一，這個(gè)亞家族的每個(gè)成員都含有一個(gè)潛在的跨膜結(jié)構(gòu)域，在細(xì)胞表面表達(dá)。MMP14 參與MMP2 的激活，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［2，3］，同時(shí)MMP14 也與血管生成有關(guān)［4］。有關(guān)豬MMP14 基因功能的研究較少，課題組在前期的PAM 細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析中發(fā)現(xiàn)MMP14 基因在PRRSV 感染前后的PAM 細(xì)胞中差異表達(dá)，且存在2 種不同的MMP14 轉(zhuǎn)錄本（XM_021098303.1 和NM_214239.2），推測(cè)該基因參與PRRSV 感染過(guò)程。因此本研究進(jìn)一步分析了MMP14 的不同轉(zhuǎn)錄本在PRRSV 感染PAM 中的表達(dá)特征，為揭示PRRSV 感染宿主細(xì)胞的分子機(jī)制充實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5 頭4～5 周齡的健康大白豬來(lái)自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所示范豬場(chǎng)；PRRSV-WUH3 毒株來(lái)源于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)。PBS 緩沖液、RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自Gibico 公司；Invitrogen TRIzol 試 劑、Thermo ScientificTMRevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis 試劑盒購(gòu)自Thermo 公司；THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 試劑盒購(gòu)自Takara 公司。

1.2 儀器

紫外微量分光光度計(jì)購(gòu)自Nanodrop 公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo 公司；普通PCR 儀購(gòu)自Bio-Rad 公司；LightCycler480 熒光定量PCR 儀購(gòu)自Roche 公司；電泳儀、凝膠成像分析儀均購(gòu)自北京市六一儀器廠。

1.3 PAM 細(xì)胞分離培養(yǎng)

選擇4～5 周齡的健康大白豬（PRRSV 等各病原檢測(cè)陰性），在干凈無(wú)菌的環(huán)境中屠宰取全肺，用PBS 緩沖液（加1% 青霉素和鏈霉素）分批次緩慢灌入肺中（400～500 mL），每次對(duì)灌滿(mǎn)的肺進(jìn)行肺部按摩，并用吸管輕輕吹打，使其細(xì)胞團(tuán)及黏液塊打散，用無(wú)菌紗布過(guò)濾收集灌洗液，1 600 r/min 離心10 min 收集細(xì)胞。收集的細(xì)胞用RPMI 1640 培養(yǎng)液（加1% 青霉素和鏈霉素）進(jìn)行洗滌，1 600 r/min 離心10 min；重復(fù)洗滌1～2 次。將洗滌好的細(xì)胞用含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液重懸后，培養(yǎng)于10 cm 培養(yǎng)皿中，37 ℃、5% 的CO2培養(yǎng)2 h。除去未貼壁的細(xì)胞，余下細(xì)胞即可消化轉(zhuǎn)入需要的6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。分離的細(xì)胞用不完可以?xún)龃?，用?xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，進(jìn)行分裝凍存。

1.4 PRRSV 感染

PAM 細(xì)胞貼壁培養(yǎng)過(guò)夜后，用0.5 MOI 劑量的PRRSV-WUH3 毒株感染PAM 細(xì)胞，吸附1 h 后，用含2% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。感染24 h 后收集細(xì)胞，利用Trizol 消化細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA。對(duì)照組PAM 細(xì)胞用RPMI 1640 培養(yǎng)基替代PRRSV 毒株處理。

1.5 PAM 細(xì)胞總RNA 抽提與cDNA 制備

利用Trizol、氯仿法提取PAM 細(xì)胞總RNA。使用紫外微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 樣品濃度與OD值，利用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性。取1 μg 的總RNA 樣本，利用Thermo ScientificTMRevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis 試劑盒，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。

1.6 MMP14 不同轉(zhuǎn)錄本熒光定量檢測(cè)

根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中豬MMP14 基因（登陸號(hào)為NC_010449.5）的2 種轉(zhuǎn)錄本（XM_021098303.1和NM_214239.2）cDNA 序列設(shè)計(jì)3 對(duì)引物，引物序列如表1 所示，其位置如圖1 所示。熒光定量PCR 采 用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 試 劑盒，反應(yīng)體系20.0 μL：qPCR mix 10.0 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，cDNA 模板1.0 μL，滅菌雙蒸水8.0 μL。利用Light-Cycler480 熒光定量PCR 儀，以β-actin 作為內(nèi)參，進(jìn)行熒光定量PCR 試驗(yàn)，用2-ΔΔCt 法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，每組試驗(yàn)做3 個(gè)平行，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，循環(huán)40 次。

1.7 MMP14 不同轉(zhuǎn)錄編碼蛋白生物信息學(xué)分析

圖1 MMP14 不同轉(zhuǎn)錄本熒光定量檢測(cè)引物設(shè)計(jì)位置

表1 熒光定量PCR 引物序列

蛋白質(zhì)跨膜螺旋采用在線(xiàn)工具TMHMM-2.0（https：//services. healthtech. dtu. dk/service. php？TMH MM-2.0）預(yù)測(cè)，蛋白的功能結(jié)構(gòu)域采用CDD 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam.sanger.ac.uk/）預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬MMP14 基因不同轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)GeneBank 數(shù)據(jù)庫(kù)信息，豬MMP14 存在2個(gè)轉(zhuǎn)錄本分別是 XM_021098303.1 和 NM_214239.2，是MMP14 基因序列不同剪切導(dǎo)致的。XM_021098303.1 全長(zhǎng)4 066 bp，由9 個(gè)外顯子序列拼接而成，CDS 編碼序列為1 785 bp，編碼594 個(gè)氨基酸的蛋白（登錄號(hào)為XP_020953962.1）。另一個(gè)轉(zhuǎn)錄本NM_214239.2 全長(zhǎng)3 673 bp，由10 個(gè)外顯子序列拼接而成，CDS 編碼序列為1 743 bp，編碼580個(gè)氨基酸的蛋白（登錄號(hào)為NP_999404.2）。2 個(gè)轉(zhuǎn)錄本cDNA 序列最大的區(qū)別在于NM_214239.2 在XM_021098303.1 第3 個(gè)外顯子處剪切掉一段351 bp 的序列。

根據(jù)以上特征，本研究設(shè)計(jì)了3 對(duì)熒光定量PCR 引物，第1 對(duì)引物（MMP14-F1）只能擴(kuò)增出XM_021098303.1 序列，第2 對(duì)引物（MMP14-F2）只能擴(kuò)增出NM_214239.2 序列，而第3 對(duì)引物（MMP14-F3）2 種轉(zhuǎn)錄本均能擴(kuò)增出來(lái)。在PRRSV感染24 h 后的PAM 細(xì)胞中，分別采用以上3 對(duì)引物檢測(cè)MMP14 不同轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)情況，結(jié)果如圖2所示。 由圖2 可知，與未感染組（MOCK）相比，PRRSV 感染組MMP14 表達(dá)量整體下調(diào)，其中轉(zhuǎn)錄本NM_214239.2 表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05），而轉(zhuǎn)錄本XM_021098303.1 表達(dá)量卻極顯著上調(diào)（P＜0.01）。

圖2 豬PAM細(xì)胞中MMP14基因不同轉(zhuǎn)錄本定量檢測(cè)結(jié)果

2.2 豬MMP14 基因不同轉(zhuǎn)錄本編碼蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

轉(zhuǎn)錄本XM_021098303.1 編碼的蛋白為XP_020953962.1，由594 個(gè)氨基酸組成；另一個(gè)轉(zhuǎn)錄本NM_214239.2 編碼的蛋白為NP_999404.2，由580個(gè)氨基酸組成。2 種編碼的蛋白序列主要是前端序列有差異，如圖3 中下劃線(xiàn)區(qū)域的序列所示。利用生物信息學(xué)工具TMHMM-2.0 分析蛋白質(zhì)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域，發(fā)現(xiàn)這2 種蛋白均具有明顯的跨膜功能區(qū)（圖4），說(shuō)明2 種蛋白的序列差異并不影響蛋白的跨膜功能。在此基礎(chǔ)上，利用CDD 和Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)分析2 種蛋白的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如圖5 所示。由圖5可知，2 種蛋白都具有MMP 蛋白家族的典型結(jié)構(gòu)域，如基質(zhì)蛋白酶（Peptidase_M10，Matrixin）和血紅蛋白樣重復(fù)結(jié)構(gòu)（HX，Hemopexin-like repeats）。其主要區(qū)別是XM_021098303.1 編碼的XP_020953962.1 蛋白缺少1 個(gè)假定肽聚糖結(jié)合域（PG_binding_1，Putative peptidoglycan binding domain）。

圖3 MMP14 不同轉(zhuǎn)錄本編碼蛋白的氨基酸序列

圖4 MMP14 不同轉(zhuǎn)錄本編碼蛋白膜跨越區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果

圖5 MMP14 不同轉(zhuǎn)錄本編碼蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果

3 小結(jié)與討論

MMP 家族是一類(lèi)高度同源的鋅離子和鈣離子依賴(lài)肽鏈內(nèi)切酶，以無(wú)活性的酶原形式進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)過(guò)激活之后才具有酶活性。它以能夠降解多種細(xì)胞外基質(zhì)組分和非基質(zhì)蛋白質(zhì)而聞名，是各種生物活性分子如趨化因子、促炎性細(xì)胞因子、絲氨酸蛋白酶和生長(zhǎng)因子抑制劑等的重要調(diào)節(jié)因子，在許多生理過(guò)程中起著重要作用，如組織重塑、胚胎發(fā)育、傷口愈合以及組織防御機(jī)制和免疫應(yīng)答等［5，6］。MMP14是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)膜型MMP，含有跨膜結(jié)構(gòu)域，在細(xì)胞表面表達(dá)。與MMP 家族蛋白相同，MMP14 本身以酶原形式合成，經(jīng)氟林蛋白酶樣蛋白水解酶活化，然后分泌至胞外表達(dá)于細(xì)胞膜上［7］。

本研究在PAM 細(xì)胞中鑒定了豬MMP14 基因的2 種不同轉(zhuǎn)錄本，并發(fā)現(xiàn)2 種轉(zhuǎn)錄本在PRRSV感染細(xì)胞后差異表達(dá)，且趨勢(shì)不同。PRRSV 感染后轉(zhuǎn)錄本NM_214239.2 顯著下調(diào)表達(dá)（P＜0.05），而轉(zhuǎn)錄本XM_021098303.1 卻極顯著上調(diào)表達(dá)（P＜0.01）。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，豬MMP14 的2 種不同轉(zhuǎn)錄本編碼的蛋白均保留了跨膜的活性，這也與此類(lèi)蛋白主要在細(xì)胞膜表面表達(dá)相符［2-4］。同時(shí)，基質(zhì)蛋白酶、血紅蛋白樣重復(fù)結(jié)構(gòu)等MMP 蛋白家族的典型結(jié)構(gòu)均相同。MMP14 的血紅素域能和CD44 結(jié)合，與細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架的重排、細(xì)胞遷移、侵襲以及MMP2 的激活有關(guān)［8］。

本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本XM_021098303.1 編碼的XP_020953962.1 蛋白缺少1 個(gè)肽聚糖結(jié)合域（PG_binding_1），這個(gè)結(jié)合域由3 個(gè)螺旋組成，位于多種參與細(xì)菌細(xì)胞壁降解酶的N 或C 端。該結(jié)合域可能具有肽聚糖結(jié)合功能，在大部分MMP 蛋白家族中均存在，是N-末端催化領(lǐng)域的基質(zhì)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)該結(jié)合域與肽聚糖結(jié)合［9］，肽聚糖是人類(lèi)免疫系統(tǒng)的免疫增強(qiáng)劑，能刺激單核吞噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞釋放免疫調(diào)控物質(zhì)，如腫瘤壞死因子α（TNFα）、白介 素（IL-1、IL-6、IL-8、IL-12）、干擾 素α（IFN-α）等［10］。研究還發(fā)現(xiàn)MMP14 前肽結(jié)構(gòu)域末端的RRKR 基序，能夠被弗林蛋白酶或者相關(guān)的前蛋白轉(zhuǎn)化酶水解，從而激活MMP14 蛋白前體［11，12］。XP_020953962.1 蛋白的前肽序列缺少RRKR 基序和PG_binding_1 功能區(qū)，可能導(dǎo)致MMP14 蛋白前體無(wú)法被活化，不具有降解細(xì)胞外基質(zhì)等活性。PRRSV 感染細(xì)胞后，轉(zhuǎn)錄本NM_214239.2 下調(diào)表達(dá)而轉(zhuǎn)錄本XM_021098303.1 上調(diào)表達(dá)，可能會(huì)導(dǎo)致具有功能活性的MMP14 蛋白減少。MMP14 蛋白最主要的功能是促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，能水解多種細(xì)胞外基質(zhì)組分和血清蛋白，如I 型膠原、纖連蛋白、玻連蛋白、層粘連蛋白、載脂蛋白等；還可以脫落細(xì)胞表面生物分子，如CD44、多配體聚糖-1、E-鈣粘蛋白等；另外還可以水解細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子等［13］。PRRSV 感染能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量的炎性因子和趨化因子，而這些細(xì)胞因子在PRRSV感染所引起的先天性免疫反應(yīng)以及炎性損傷中發(fā)揮重要的作用［14］，如PRRSV 感染后引起外周血單核細(xì)胞中趨化因子IL-8 的上調(diào)［15，16］，IL-8 等趨化因子在病毒感染所引起的炎性反應(yīng)和免疫損傷中發(fā)揮重要作用［17］。Ait-ali 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV 感染能力較低的品種豬PMA 中，IL-8 分泌大量減少，細(xì)胞因子的合成以及分泌在PRRSV 感染引起的先天性免疫反應(yīng)中也具有重要功能。綜上，推測(cè)PRRSV 感染后抑制MMP14 蛋白活性，與PRRSV 刺激細(xì)胞因子與趨化因子的大量表達(dá)相關(guān)。然而，MMP14 在PRRSV 感染中的具體作用還有待進(jìn)一步研究。