高希龍，韓夢琪，黃明慧，張倩茹，李 華，羅 星

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院，山東 煙臺 264003）

中國擁有十分豐富的秸稈資源［1］，據(jù)統(tǒng)計，中國每年農(nóng)作物秸稈資源達6 億多噸［2］。山東省作為農(nóng)業(yè)大省，年均農(nóng)作物秸稈可收集量達4 600 萬t［3］，其中小麥秸稈可收集量占近1/2［4］。花生作為山東省特別是煙臺市地區(qū)特色經(jīng)濟作物，種植面積達12萬hm2以上，產(chǎn)量達40 萬t［5］。秸稈是一種具有多用途的生物資源，含有纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)、脂肪和灰分等有機物質(zhì)及氮、磷、鉀、鈣、鎂和硅等礦質(zhì)元素［6］?；ㄉ斩捴懈缓袡C質(zhì)、氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素［7］，花生紅衣中還含有多種多酚物質(zhì)［8］。傳統(tǒng)的秸稈利用方式大多是能源化利用［6］，有少部分用于飼料［9］。

生化富里酸是一類成分復(fù)雜的天然有機物［10］，具有分子量較小、水溶性高、活性成分含量高等特點［11］，能夠增強農(nóng)作物的抗病能力，提高農(nóng)作物品質(zhì)［12］。本研究以小麥秸稈、花生秸稈、花生紅衣為原料，利用發(fā)酵法生產(chǎn)生化富里酸，通過單因素法探究生產(chǎn)生化富里酸的最佳工藝，以期為生化富里酸工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥秸稈、花生秸稈，取自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院試驗基地；花生紅衣，取自牟平長生奶牛場；發(fā)酵菌（混合堆肥發(fā)酵菌），由文登海龍養(yǎng)殖場提供；紅糖、玉米淀粉，均為市售；生化富里酸標(biāo)準(zhǔn)品，購自麥克林公司。

1.2 儀器與藥品

pH 計（BPH-200D 型），購自貝爾分析儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9272），購自精宏公司；分析天平（MS-TS），購自梅特勒-托利多公司；水浴恒溫振蕩器（SHA-B），購自常州億通分析儀器制造公司；恒溫干燥箱（DZF-6030），購自蘇州納美瑞科技有限公司；循環(huán)抽濾泵（SHZ-III），購自上海知信公司；高溫電阻爐（SX-2.5-10），購自林茂科技有限公司；粉碎機，購自新加特公司；分光光度計（752N），購自上海儀電公司。

氫氧化鈉、硼酸、溴甲酚綠、甲基紅、乙醇、濃硫酸、硫酸亞鐵、凡士林、碳酸氫鈉、鹽酸、鉬酸銨、抗壞血酸、磷酸二氫鉀、碳酸鈣、丙酮、尿素等均為分析純，購自煙臺健碩化工有限公司；去離子水為實驗室自制。

1.3 方法

1.3.1 生化富里酸的測定 采用容量法測定樣品中的生化富里酸產(chǎn)量［13］。容量法是用焦磷酸鈉溶液從樣品中抽提出生化富里酸，在強酸溶液中用過量K2Cr2O7溶液，將腐植酸中的C 氧化成CO2，然后用FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定過量的K2Cr2O7，根據(jù)K2Cr2O7消耗量和生化富里酸的含C 比，計算出樣品中生化富里酸的產(chǎn)量，具體測定方法如下。

準(zhǔn)確稱取待測樣品0.200 0～0.500 0 g（精確到0.000 1 g），放入250 mL 錐形瓶中。加入焦磷酸鈉溶液100 mL，置于沸水浴中加熱抽提2 h，取出，定容至250 mL 容量瓶中（V），準(zhǔn)確移取10 mL 于250 mL錐形瓶中，加入5 mL K2Cr2O7溶液，于沸水浴中加熱氧化30 min。將氧化后的溶液取下，冷卻至室溫，分別加入約70 mL 水、3 滴1，10-菲洛琳-硫酸亞鐵銨混合指示劑，用硫酸亞鐵銨標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，溶液由橙色經(jīng)綠色變?yōu)榇u紅色即為滴定終點。計算公式如下：

式中，0.003 為碳質(zhì)量系數(shù)（g）；V0為空白體積；V3為待測液滴定體積；CFe2+為硫酸亞鐵銨標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度；V 為待測液定容體積；k 為生化富里酸的碳系數(shù)；m 為待測樣品質(zhì)量；V1為待測液體積；V2為移取體積。

1.3.2 秸稈預(yù)處理 小麥秸稈、花生秸稈、花生紅衣用烘干法測量含水率，灼燒法測定灰分含量。恒溫干燥箱105 ℃烘干后粉碎，過40 目篩，密封后放入冰箱，4 ℃保存。由表1 可知，花生秸稈灰分含量最高，為6.89%，小麥秸稈的粗纖維含量最高，為37.00%，花生秸稈與花生紅衣的含氮量較高。

表1 秸稈理化指標(biāo) （單位：%）

1.3.3 原料發(fā)酵 取一定量的小麥秸稈、花生紅衣、花生秸稈放入發(fā)酵桶中，加入適量紅糖、淀粉、尿素、發(fā)酵菌，用去離子水調(diào)節(jié)含水率為60.00%，放入培養(yǎng)箱中調(diào)節(jié)不同溫度進行發(fā)酵，檢測生化富里酸產(chǎn)量的變化。

1.3.4 生化富里酸提取 將發(fā)酵料中加入一定比例的水，用擠壓法提取發(fā)酵液，用氫氧化鈉、濃鹽酸調(diào)節(jié)pH，靜置1 h，4 000 r/min 離心15 min，得生化富里酸精制液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對精制液進行濃縮，60～70 ℃烘干，得生化富里酸精粉。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 利用Excel 軟件對得到的試驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類秸稈對生化富里酸產(chǎn)量的影響

發(fā)酵過程是一個利用微生物降解大分子有機物的生物化學(xué)過程，不同種類的秸稈成分不同［14］，制備的生化富里酸產(chǎn)量有差異。將小麥秸稈、花生紅衣、花生秸稈、小麥秸稈∶花生秸稈=1∶1 的混合秸稈在培養(yǎng)箱中40 ℃發(fā)酵240 h，每隔24 h 取樣檢測生化富里酸的產(chǎn)量變化，結(jié)果見表2。由表2 可知，發(fā)酵初期微生物活性大，生化富里酸產(chǎn)量增加較快。發(fā)酵120 h 后生化富里酸產(chǎn)量增加變慢，216 h 達到最大，之后變化不大。其中，混合秸稈的生化富里酸產(chǎn)量顯著高于其他秸稈，達74.38 g/kg。說明混合秸稈綜合了小麥秸稈與花生秸稈2 種秸稈的原料優(yōu)點。

表2 不同秸稈發(fā)酵過程中生化富里酸的產(chǎn)量變化

2.2 不同配比小麥秸稈與花生秸稈混合物對生化富里酸產(chǎn)量的影響

小麥秸稈與花生秸稈以質(zhì)量比2∶1、1∶1、1∶2 混合進行發(fā)酵，檢測發(fā)酵216 h 時生化富里酸產(chǎn)量。由圖1 可見，小麥秸稈與花生秸稈質(zhì)量比為2∶1 混合后發(fā)酵，生化富里酸產(chǎn)量顯著高于其他兩組。

圖1 不同配比小麥秸稈與花生秸稈混合物對生化富里酸產(chǎn)量的影響

2.3 不同發(fā)酵溫度對生化富里酸產(chǎn)量的影響

溫度影響發(fā)酵菌的活性，適宜的溫度能提高生化富里酸的產(chǎn)量。將混合秸稈原料分別在25、30、35、40、45 ℃的溫度下進行發(fā)酵，發(fā)酵216 h 時檢測生化富里酸產(chǎn)量。由圖2 可知，不同溫度下發(fā)酵出的生化富里酸產(chǎn)量差異較大，在溫度為35 ℃下發(fā)酵的生化富里酸產(chǎn)量達87.50 g/kg，顯著高于其他溫度下的發(fā)酵產(chǎn)量。

圖2 不同發(fā)酵溫度對生化富里酸產(chǎn)量的影響

2.4 不同添加劑對生化富里酸產(chǎn)量的影響

有研究表明，在發(fā)酵過程中，采用人工接菌的方式比自然發(fā)酵更有利于發(fā)酵底物的生物降解，促進生化富里酸的生成［15］。添加氮源時應(yīng)考慮氮源的水溶性以及成本要素，經(jīng)過借鑒相似研究并結(jié)合實驗室條件，本研究確定選取尿素作為氮源［16］。秸稈中氮含量較低，用尿素補充氮源，添加菌劑能迅速形成優(yōu)勢菌群，有利于發(fā)酵的快速高效進行。以混合秸稈為原料，添加不同量的尿素和菌劑，添加劑加入量如表3 所示。將添加不同量尿素和菌劑的各組分別在35 ℃下發(fā)酵216 h，檢測生化富里酸產(chǎn)量（圖3）。由圖3 可知，第5 組和第6 組具有較高的生化富里酸產(chǎn)量，說明尿素添加量較低時氮源不足，不利于發(fā)酵，當(dāng)尿素添加量達2% 時顯著促進了發(fā)酵；菌劑的加入能促進發(fā)酵，加入3% 菌劑促進效果顯著，過多加入又會抑制發(fā)酵。因此尿素和菌劑添加2%和3% 時具有較好的生化富里酸產(chǎn)量。

表3 各組尿素含量與接種量處理水平 （單位：%）

圖3 不同添加劑對生化富里酸產(chǎn)量的影響

3 小結(jié)與討論

本研究以小麥秸稈、花生秸稈、花生紅衣為原料發(fā)酵生產(chǎn)生化富里酸，通過單因素試驗探索制備最佳工藝，得到以下結(jié)論：①混合秸稈比單一秸稈制備效果好，其中小麥秸稈和花生秸稈按照質(zhì)量比2∶1混合后發(fā)酵具有較高的生化富里酸產(chǎn)量；②發(fā)酵過程中要嚴(yán)格控制條件，35 ℃發(fā)酵216 h，生化富里酸產(chǎn)量最高；③添加劑對發(fā)酵影響較大，添加適量的尿素和發(fā)酵菌劑有助于提高生化富里酸產(chǎn)量。

利用農(nóng)作物秸稈為原料生產(chǎn)生化富里酸是秸稈高附加值利用的全新探索。產(chǎn)出的生化富里酸水溶性好，生物活性強。在土壤改良方面，能夠有效降低土壤容重，增強透氣性，有利于耕作［17］；在提高作物抗逆性方面，外源生化富里酸處理的作物可改善鹽脅迫下作物的光合作用，緩解鹽脅迫對作物的危害［18］；在肥料生產(chǎn)方面，生化富里酸可以充當(dāng)復(fù)合材料、功能材料、抗逆材料［19］。可見通過秸稈發(fā)酵制備生化富里酸有助于促進高效生態(tài)農(nóng)業(yè)、綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展，盡快實現(xiàn)向可持續(xù)發(fā)展的循環(huán)型農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)型［20］。本研究旨在為生產(chǎn)生化富里酸提供新途徑，同時也為其他方法制備生化富里酸提供參考。