彭勇，黃嫻倩，張可悅，應(yīng)穎，褚贊波，吳玉寒，潘迎紫，陳勇

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性的以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的自身免疫性疾病，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)的進(jìn)行性破壞，最終導(dǎo)致殘疾，全球人群的患病率大約 1%[1]。迄今為止，對(duì)于RA的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，且目前尚無(wú)根治方法。臨床上治療的主要目標(biāo)是控制癥狀和延緩疾病進(jìn)展，而現(xiàn)有的治療方法對(duì)部分患者無(wú)效[2]。

RA是由環(huán)境因素和遺傳因素等多種因素導(dǎo)致的一種復(fù)雜疾病，其中遺傳因素起主要作用，但傳統(tǒng)的遺傳學(xué)并不能完美的解釋RA的發(fā)病過(guò)程。表觀遺傳是指不涉及DNA序列改變的情況下，基因功能發(fā)生可逆、可遺傳的改變。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的，也是被研究最多的基因表觀修飾方式之一。DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyItransferases, DNMTs)的作用下，由S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供甲基基團(tuán)，將CpG島二核苷酸的胞嘧啶(C)甲基化為5-甲基化胞嘧啶(5-mC)的過(guò)程。DNA 甲基化在維持基因組及染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、基因激活及沉默中具有重要作用。近年來(lái)，DNA甲基化在RA的發(fā)病、診斷和治療中的作用已逐步被發(fā)現(xiàn)[3]。疾病與候選基因甲基化狀態(tài)的關(guān)聯(lián)研究受研究者主觀因素、基因數(shù)量、統(tǒng)計(jì)效應(yīng)等影響，容易遺漏真正的疾病關(guān)聯(lián)基因。本研究通過(guò)高通量DNA甲基化基因芯片檢測(cè)技術(shù)(illumina human methylation EPIC BeadChip 850 K)對(duì)早期RA患者和健康人群全血的全基因組DNA進(jìn)行差異甲基化位點(diǎn)分析，篩選出2組差異甲基化位點(diǎn)，根據(jù)差異甲基化位點(diǎn)尋找相關(guān)差異基因；通過(guò)分析相關(guān)基因參與的生物學(xué)過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組成及信號(hào)通路，進(jìn)一步探索DNA異常甲基化與RA發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)系，為DNA甲基化在RA的診斷及治療方面提供線索和依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

隨機(jī)選取2018年6月至2019年8月就診于中國(guó)科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院門診的12例女性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者為RA組。RA組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)診斷符合2010年 ACR/EULAR 制定的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎分類標(biāo)準(zhǔn)[4]；(2)初治(1個(gè)月內(nèi)未接受過(guò)糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及生物質(zhì)制的治療)，病程≤6月；(3)疾病處于活動(dòng)期，RA疾病活動(dòng)評(píng)分：DAS 28評(píng)分>3.2。選取年齡及性別配對(duì)的體檢中心體檢的12名健康者作為對(duì)照組，無(wú)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎家族史。排除標(biāo)準(zhǔn)：兩組均排除其他風(fēng)濕性疾病、癌癥、精神病等疾病，且均無(wú)血緣關(guān)系。本研究已通過(guò)中國(guó)科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及濃度測(cè)定:獲取RA組和對(duì)照組晨起、空腹8 h以上的外周靜脈血2 mL于EDTA抗凝管中，采用QIAamp DNA試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)提取全基因組DNA；運(yùn)用Thermo Nanodrop 2000分光光度儀測(cè)定DNA濃度及純度。檢測(cè)DNA濃度并記錄(OD260/OD280 比值應(yīng)在 1.8～2.0)，-80 ℃保存。

1.2.2 DNA修飾:應(yīng)用Zymo EZ DNA Methylation Kit試劑盒(美國(guó)Zymo公司)對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾，使DNA甲基化。

1.2.3 DNA擴(kuò)增、斷裂、雜交:本部分由上海歐意生物醫(yī)學(xué)科技有限公司提供技術(shù)支持，完成實(shí)驗(yàn)并分析。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增后將DNA片段化，片段化的DNA沉淀回溶，采用Illumina Human Methylation EPIC BeadChip 850 K 甲基化基因芯片(美國(guó)Infinium公司)進(jìn)行雜交。應(yīng)用芯片掃描軟件iscan對(duì)芯片灰度掃描，掃描結(jié)果使用GenomestudioV2011.1(美國(guó) Illumina 公司)進(jìn)行分析。

1.2.4 原始數(shù)據(jù)的質(zhì)控:為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，實(shí)驗(yàn)中對(duì)甲基化芯片雜交過(guò)程進(jìn)行了嚴(yán)格的質(zhì)控分析。對(duì)每樣品提供12 332個(gè)probe作為質(zhì)控項(xiàng)目，主要包括兩部分：(1)sample-independent control:Staining Control、Hybridization Control、Target Removal Contro、Extension Control；(2)sample dependent control: Bisulfite conversion control、Stringency Control、Non-sepecific Binding Control、Non-ploymorphic Control等，結(jié)果符合Infinium正常實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，芯片狀態(tài)正常。

1.3 差異甲基化基因的篩選方法和標(biāo)準(zhǔn)

用于比較的2組DNA都設(shè)置3次重復(fù)及以上則采用T-Test Model，比較每個(gè)基因甲基化位點(diǎn)在RA組與正常對(duì)照組間的差異(P<0.05)，可獲得甲基化水平發(fā)生改變的基因位點(diǎn)；再將得到的P值轉(zhuǎn)化為Diff score值[Diff score=10×sgn(βref-βcond) ×log10(P)；對(duì)照組的Diff score為0]，Diff Score取正值代表RA組相對(duì)對(duì)照組甲基化程度升高，負(fù)值相反。設(shè)定RA組樣本Diffscore值<-13或>13；且Delta_Beta>0.17或<-0.17，即為顯著差異甲基化基因；其中Delta_Beta值的計(jì)算，即為對(duì)照組與RA組Avg_Beta相差的結(jié)果，即RA組與對(duì)照組在每個(gè)位點(diǎn)的甲基化差異程度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

芯片經(jīng)iSCAN灰度掃描后，應(yīng)用GenomestudioV2011.1軟件行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換與數(shù)據(jù)歸一化，可以得到芯片上每個(gè)甲基化點(diǎn)非甲基化探針和甲基化探針強(qiáng)度的原始信號(hào)值。經(jīng)過(guò)美國(guó)Illumina公司提供的方法進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化，得到甲基化點(diǎn)的水平值(Avg-Beta)，DetectionPvalue等。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，應(yīng)用t檢驗(yàn)比較每個(gè)基因甲基化位點(diǎn)在RA組與正常對(duì)照組間的差異。采用R2.15.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)差異CpG點(diǎn)進(jìn)行聚類分析；對(duì)差異甲基化點(diǎn)所在的基因作Gene Ontology分析；并采用京都基因和基因百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Pathway分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象基本信息

2組研究對(duì)象的基本臨床信息，包括性別、年齡、民族、血沉、C反應(yīng)蛋白、病程、DAS-28評(píng)分等見(jiàn)表 1。健康對(duì)照組的性別、年齡及民族與RA組基本匹配，且差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 差異甲基化點(diǎn)分析

RA組與對(duì)照組相比，共有24 183個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化水平發(fā)生改變(P<0.05)，其中有13 672個(gè)高甲基化位點(diǎn)，10 511個(gè)低甲基化位點(diǎn)，RA組全基因組的高甲基化位點(diǎn)約占差異性位點(diǎn)的56.5%。進(jìn)一步根據(jù)差異甲基化基因篩選標(biāo)準(zhǔn)，RA組顯著差異甲基化位點(diǎn)共191個(gè)，其中上調(diào)的差異表達(dá)基因有106個(gè),下調(diào)的差異表達(dá)基因有85個(gè)(圖 1)。191個(gè)甲基化位點(diǎn)共對(duì)應(yīng)著115個(gè)基因，根據(jù)Beta-Difference值大小展示了高甲基化(表2)和低甲基化(表3)程度差異最明顯的一些基因位點(diǎn)的信息。通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)其中15個(gè)差異化基因可能與RA相關(guān)，其中高甲基化基因如IL-26、PCSK6、MICB、NCF4、GALNT9、PHF19、ACTN1等，低甲基化基因如CYP2E1、SMAD3、SLC1A1、CD44、AGPAT1、KCNQ1、AHRR等。對(duì)191個(gè)差異甲基化位點(diǎn)進(jìn)行聚類分析(圖2)，RA 組和對(duì)照組被清晰正確地聚類，說(shuō)明篩選出的差異甲基化位點(diǎn)有良好的鑒別力。在191個(gè)顯著差異的甲基化位點(diǎn)中，RA組較對(duì)照組存在更多的高甲基化位點(diǎn)，而對(duì)照組存在較多低甲基化位點(diǎn)。

表1 RA組與對(duì)照組人群的基本信息表Table 1 Basic information of RA group and control group

2.3 Gene Ontology分析

對(duì)差異甲基化位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的115個(gè)基因進(jìn)行注釋分析，通過(guò)運(yùn)用Database for Annotation, Visualiza-tion and Integrated Discovery 6.8(DAVID數(shù)據(jù)庫(kù))對(duì)差異甲基化區(qū)域的分子功能生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行富集度分析(Gene Ontology enrichment analysis, GO分析)，包括生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成以及分子功能，結(jié)果按P值排序排列(padj<0.05)。差異甲基化基因參與生物學(xué)過(guò)程富集于：細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、炎癥反應(yīng)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、T細(xì)胞活化、透明質(zhì)酸的代謝等方面(圖3)。

圖 1 RA組中差異甲基化基因火山圖Fig 1 Volcano map of differentially methylated genes in RA group

表2 Beta-diff Top 20 高甲基化基因位點(diǎn)Table 2 Beta diff top 20 hypermethylation gene loci

表3 Beta-diff Top 16 低甲基化基因位點(diǎn)Table 3 Beta diff top 16 hypomethylation gene loci

圖 2 RA組和對(duì)照組191個(gè)差異甲基化位點(diǎn)聚類圖

2.4 Pathway分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異甲基化位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因進(jìn)行Pathway分析，RA組特異的差異甲基化基因與沙門菌感染、Toll樣受體信號(hào)通路、炎性腸病、NF-κB信號(hào)通路、TRP通道的炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)、趨化因子信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等信號(hào)通路有關(guān)，共計(jì)18個(gè)通路具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(padj<0.05)(圖 4)。

圖 4 RA組與對(duì)照組差異甲基化基因Pathway分析結(jié)果Fig 4 Pathway analysis results of different methylation genes between RA group and control group

3 討論

DNA甲基化幾乎只存在于人類DNA的CpG島，在人類基因組中大約有30 000個(gè)CpG島；而約60%～70%的基因啟動(dòng)子與CpG島相關(guān)，這表明CpG島甲基化是基因表達(dá)調(diào)控的重要組成部分[5]。因此，異常的DNA甲基化可在不改變DNA核苷酸序列的情況下使基因失活及轉(zhuǎn)錄抑制。DNA甲基化具有遺傳穩(wěn)定的特性，在經(jīng)歷多次細(xì)胞分裂后仍可被穩(wěn)定地遺傳；此外，DNA甲基化也是唯一一種在DNA提取和純化后仍存在的表觀遺傳修飾[6]；與基因突變相反，DNA甲基化這一表觀遺傳修飾同時(shí)是可逆的。因?yàn)檫@些特征，DNA甲基化是目前被研究的最多的一種表觀遺傳修飾方式。目前與DNA甲基化相關(guān)的疾病包括各種腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心臟疾病及免疫系統(tǒng)疾病[7]。

國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)，RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)和RA成纖維樣滑膜細(xì)胞(RA-FLS)的DNA存在廣泛的低甲基化[8]，而最新的國(guó)外研究則發(fā)現(xiàn)，早期RA患者的T-淋巴細(xì)胞和B-淋巴細(xì)胞中DNA存在廣泛的高甲基化[9]。另一些研究表明，RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL-6基因的啟動(dòng)子甲基化水平明顯低于健康對(duì)照組，IL-6表達(dá)激活將促進(jìn)關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生[10]；在RA-FLS中也發(fā)現(xiàn)趨化因子配體基因CXCL12的啟動(dòng)子區(qū)域存在低甲基化，這將導(dǎo)致RA患者M(jìn)MPs表達(dá)增加以及關(guān)節(jié)破壞[11]；此外，與骨關(guān)節(jié)炎患者相比，RA患者FCRLA、CCDC88C、BCL11B、APOL6四個(gè)基因存在低甲基化和表達(dá)下調(diào)，而表達(dá)下調(diào)的CCDC88C基因可通過(guò)Wnt信號(hào)通路促進(jìn)RA疾病的進(jìn)展[12]。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)部分候選基因(c-Myc、mTOR、HIF-1α)的低甲基化可能增加RA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[13]，以上研究均表明DNA甲基化可能參與了RA的發(fā)病。

本研究發(fā)現(xiàn)，RA組與對(duì)照組相比DNA甲基化水平存在明顯差異，其中RA組全基因組的高甲基化位點(diǎn)約占差異性位點(diǎn)的56.5%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了15個(gè)與RA相關(guān)的差異基因，其中高甲基化基因如IL-26、PCSK6、MICB、NCF4、GALNT9、PHF19、ADAMTS4、ACTN1等，低甲基化基因如CYP2E1、SMAD3、SLC1A1、CD44、AGPAT1、KCNQ1、AHRR等。在高甲基化基因中，有文獻(xiàn)報(bào)道中國(guó)漢族類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者CD4+T細(xì)胞中GALNT9基因高甲基化改變[14]，這與本研究結(jié)果一致。MICB及NCF4的基因多態(tài)性參與了RA的發(fā)病[15-16]。IL-26基因表達(dá)的IL-26屬于IL-10家族，RA患者血清中IL-26的濃度高于健康人，RA滑液中IL-26的濃度顯著高于RA血清；IL-26可誘導(dǎo)RA患者單核細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF-α)，同時(shí)上調(diào)多種趨化因子的表達(dá)，還可促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化[17]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IL-26可通過(guò)增加RA-FLS中NF-κB受體活化因子配體(RANKL)的表達(dá)和直接刺激破骨細(xì)胞分化，促進(jìn)RA破骨細(xì)胞的形成[18]。在RA-FLS中前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素6 (proprotein convertase subtili-sin/kextin type 6, PCSK6)表達(dá)明顯增減，PCSK6可通過(guò)NF-κB等信號(hào)通路，促進(jìn)RA-FLS的增殖、遷移、侵襲和炎癥反應(yīng)[19]；而沉默PCSK6基因可能在RA的發(fā)生發(fā)展中起保護(hù)作用[20]。PHF19、ADAMTS4及ACTN1基因表達(dá)產(chǎn)物均參與或促進(jìn)了RA的發(fā)生發(fā)展[21]。在低甲基化基因中，Mok等[22]發(fā)現(xiàn)RA患者T淋巴細(xì)胞CYP2E1基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在顯著的低甲基化，且與RA疾病活動(dòng)和骨侵蝕相關(guān)，這與本研究結(jié)果一致。CD44基因表達(dá)的CD44蛋白是一種多形性跨膜蛋白，已有研究證實(shí)RA患者關(guān)節(jié)滑膜中存在大量CD44亞型及其配體透明質(zhì)酸，兩者結(jié)合可促進(jìn)RA的滑膜炎癥及關(guān)節(jié)軟骨的破壞[23]。KCNQ1和SMAD3的基因多態(tài)性則是RA的遺傳危險(xiǎn)因素[24-25]。此外，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)1/Smads信號(hào)通路參與了RA-FLS的遷移和侵襲，促進(jìn)了關(guān)節(jié)損傷和病理改變[26]。目前已知吸煙會(huì)增加患RA的風(fēng)險(xiǎn)，而吸煙的RA患者AGPAT1基因啟動(dòng)子區(qū)存在顯著的低甲基化，該基因表達(dá)與RA炎癥密切相關(guān)[27]。吸煙還可增加RA患者滑膜組織中芳香烴受體抑制因子(AHRR)基因的表達(dá)[28]。目前對(duì)于RA基因甲基化的研究還處于早期，本研究通過(guò)檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)15個(gè)差異甲基化的基因可能與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這將有助于揭示DNA甲基化在RA發(fā)病機(jī)制中的作用，上述差異甲基化位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因也有望成為RA發(fā)病、疾病進(jìn)展和疾病嚴(yán)重程度的生物標(biāo)記物或預(yù)測(cè)因子。

RA以女性多發(fā)，男女患病比例約為1∶3。因此，本研究以女性患者為研究對(duì)象，以期了解女性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者DNA甲基化的特征。有研究發(fā)現(xiàn)，女性RA患者CD4+T細(xì)胞中X性染色體上的CD40L啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生了低甲基化，并且發(fā)現(xiàn)CD40L mRNA表達(dá)上調(diào)，而在男性RA患者的CD4+T細(xì)胞沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這種改變[29]；這可以部分解釋RA在女性中高發(fā)的原因。本研究對(duì)象均為女性，發(fā)現(xiàn)RA組中存在115個(gè)甲基化顯著差異的基因，其中X性染色體上存在一個(gè)低甲基化基因FRMPD4，深入研究該基因甲基化改變?cè)赗A發(fā)病中的作用，可能有助于揭示女性更易患RA的遺傳背景。

通過(guò)GO分析發(fā)現(xiàn)差異甲基化的基因參與生物學(xué)過(guò)程富集于：細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、炎癥反應(yīng)、NF-κB信號(hào)通路、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、T細(xì)胞活化、透明質(zhì)酸的代謝等方面；通過(guò)Pathway分析發(fā)現(xiàn)差異甲基化的基因與Toll樣受體信號(hào)通路、炎性腸病、NF-κB信號(hào)通路、TRP通道的炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)、趨化因子信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等信號(hào)通路有關(guān)。RA是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主的自身免疫病。免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、T和B淋巴細(xì)胞向炎癥關(guān)節(jié)遷移、聚集并活化，同時(shí)多種炎癥通路如Toll樣受體信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等，促使多種促炎細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α等高表達(dá)，促使關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生[30]。因此，認(rèn)為上述差異甲基化基因可促使各種炎癥因子產(chǎn)生，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的活化，通過(guò)多種信號(hào)通路導(dǎo)致RA骨質(zhì)侵蝕及關(guān)節(jié)破壞，從而參與RA的發(fā)病和促進(jìn)疾病進(jìn)展。

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)是DNA甲基化的關(guān)鍵酶。有研究證實(shí)DNMTs的抑制劑如阿扎胞苷(5′-AZA)可下調(diào)RA小鼠FLS的多種炎癥因子的表達(dá)，從而抑制RA的進(jìn)展[31]。Svenden等[27]發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的抗風(fēng)濕藥物(如甲氨蝶呤)可以誘導(dǎo)RA炎癥相關(guān)基因AGPAT1啟動(dòng)子的低甲基化區(qū)域逆轉(zhuǎn)為高甲基化?？傊珼NA的異常甲基化參與了RA的發(fā)病過(guò)程，而抑制DNA異常甲基化可能可以抑制RA發(fā)生及發(fā)展。因此，筆者推測(cè)這些差異基因可能成為RA治療的潛在靶點(diǎn)。

本研究不足之處：首先選取的樣本量較少，且僅選了女性作為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)存在一定的局限性；其次，僅對(duì)差異化甲基基因進(jìn)行了分析，未對(duì)相關(guān)基因表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定及驗(yàn)證；在今后的研究中，筆者將擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究，同時(shí)對(duì)這些基因所表達(dá)的mRNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行深入驗(yàn)證，從而為探討DNA甲基化在RA發(fā)生發(fā)展中及治療中的作用提供依據(jù)。