萬(wàn)瑾，張倩茹，郭娟，楊研，周煒

大動(dòng)脈炎(Takayasu arteritis，TA)是一種自身免疫性大血管炎，主要累及主動(dòng)脈弓及其一級(jí)分支，受累血管可出現(xiàn)狹窄、閉塞或擴(kuò)張，從而引起相應(yīng)的臨床癥狀[1]，可有脈搏消失、頭暈、黑朦、間歇性跛行等表現(xiàn)，常伴有發(fā)熱、乏力等全身炎癥反應(yīng)。該病好發(fā)于亞洲，年輕女性多見(jiàn)，多于50歲以前起病，男女患病率約1∶4[2-3]。TA的發(fā)病原因尚不清楚，病理為全層動(dòng)脈炎性改變[4]。細(xì)胞免疫在大動(dòng)脈炎發(fā)病機(jī)制中占有重要地位，TA動(dòng)脈壁標(biāo)本可見(jiàn)較多CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤(rùn)[5]，但體液免疫是否參與仍不明確。本研究通過(guò)分析TA動(dòng)脈壁免疫細(xì)胞表達(dá)的特點(diǎn)，并與其他大動(dòng)脈病變相比較，以期探討B(tài)細(xì)胞和漿細(xì)胞是否在大血管炎發(fā)病中發(fā)揮作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

對(duì)阜外醫(yī)院經(jīng)心臟外科行手術(shù)治療的8例TA患者進(jìn)行回顧性研究，手術(shù)時(shí)間為2002年10月至2008年5月，所有患者有大動(dòng)脈壁病理標(biāo)本。8例TA均符合1990年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)大動(dòng)脈炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，采集其臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)資料，臨床分型依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病學(xué)分會(huì)發(fā)布的《大動(dòng)脈炎診斷及治療指南》[7]，包括I型：頭臂動(dòng)脈型；Ⅱ型：胸腹主動(dòng)脈型；Ⅲ型：廣泛型；Ⅳ型：肺動(dòng)脈型。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗體與試劑：鼠抗人CD20單克隆抗體，CD138單克隆抗體，CD4單克隆抗體(美國(guó)invitrogen公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠二抗(美國(guó)GBI公司)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)；蘇木素(南京凱基生物發(fā)展有限公司)。

1.2.2 病理檢查：(1)11例患者于手術(shù)中切除的動(dòng)脈壁組織常規(guī)10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)切片HE染色，進(jìn)行病理診斷。(2)免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemistry， IHC)：對(duì)石蠟包埋標(biāo)本再次切片(5 μm)，常規(guī)脫蠟水化； pH 6.0檸檬酸鹽抗原修復(fù)液高壓抗原修復(fù)。0.03%過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；3%牛血清白蛋白封閉抗原。隨后滴加一抗37 ℃孵育90 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗37 ℃避光孵育半小時(shí)。PBS清洗3次。DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。

1.2.3 結(jié)果判斷：常規(guī)HE染色，動(dòng)脈壁中除內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞以外的單個(gè)核類圓形細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，每平方毫米50個(gè)以上淋巴細(xì)胞聚集為浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞灶。IHC組織切片上細(xì)胞有50%以上的細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色著色為染色陽(yáng)性。CD4+的單個(gè)核細(xì)胞為輔助T淋巴細(xì)胞；CD20+的單個(gè)核細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞；CD138+的單個(gè)核細(xì)胞為漿細(xì)胞，計(jì)數(shù)每個(gè)動(dòng)脈壁組織切片內(nèi)輔助T細(xì)胞，B細(xì)胞和漿細(xì)胞數(shù)量。每平方毫米有50個(gè)以上CD4+T細(xì)胞、CD20+B細(xì)胞或CD138+漿細(xì)胞聚集定義為1個(gè)細(xì)胞灶。有細(xì)胞灶出現(xiàn)時(shí)，細(xì)胞灶內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于散在陽(yáng)性細(xì)胞，因此僅計(jì)數(shù)每個(gè)切片中出現(xiàn)的淋巴細(xì)胞和/或漿細(xì)胞灶數(shù)；沒(méi)有細(xì)胞聚集成灶的組織切片，計(jì)數(shù)散在CD4+T細(xì)胞、CD20+B細(xì)胞或CD138+漿細(xì)胞的數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 臨床及影像學(xué)表現(xiàn)

8例TA中，男性4例，女性4例，平均年齡(34.5±15.78)歲,病程平均為(46.13±37.47)個(gè)月。

TA患者臨床表現(xiàn)見(jiàn)表1，頭暈、黑矇、活動(dòng)后胸悶、心悸等癥狀多見(jiàn)。8例TA患者中5例ESR升高，平均(29.25±15.64) mm/h。8例TA患者血管受累較廣泛，2例Ⅱ型，6例Ⅲ型。

2.2 病理學(xué)檢查結(jié)果

8例患者均為主動(dòng)脈標(biāo)本，大體肉眼所見(jiàn)均有管壁增厚，呈“洋蔥皮”樣改變，HE染色符合大動(dòng)脈炎表現(xiàn)，其中4例可見(jiàn)淋巴細(xì)胞聚集灶，其他標(biāo)本動(dòng)脈壁中均見(jiàn)不同程度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(表1，圖1)。

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

8例TA中， 6例CD4+輔助T細(xì)胞聚集成灶(圖2A)，2例散在分布，分別計(jì)數(shù)64個(gè)和91個(gè)細(xì)胞(表1)；6例CD20+B細(xì)胞灶性浸潤(rùn)(圖2B)，2例散在分布，分別計(jì)數(shù)13個(gè)和69個(gè)細(xì)胞(表1)；3例見(jiàn)到大量CD138+漿細(xì)胞浸潤(rùn)(表1)并聚集成灶(圖2C)。

表1 8例TA患者臨床表現(xiàn)、影像學(xué)結(jié)果及病理表現(xiàn)Table 1 Clinical manifestations, radiological image findings, and the pathological characteristics of aorticwall biopsy of 8 TA patients

圖 1 TA動(dòng)脈壁組織病理圖片(TA動(dòng)脈壁中見(jiàn)炎癥細(xì)胞灶性浸潤(rùn))(HE染色,×100)Fig 1 A massive inflammatory infiltrating foci within the adventitia of an aortic specimen from a patient with Takayasu arteritisHematoxylin-eosin staining(×100)

圖 2 TA動(dòng)脈壁免疫組化染色Fig 2 Distribution of (A,B) CD4+T cells,(C,D) CD20+B cells and (E,F) CD138+ plasma cells in a massive inflammatory infiltrating foci within the adventitia of an aortic specimen from a patient with Takayasu arteritisA：CD4+T細(xì)胞呈灶狀分布(EliVision法,×100)；B：A放大圖(×400)；C：CD20+B細(xì)胞呈多量浸潤(rùn)分布(EliVision法,×100)；D：C放大圖(×400)；E：CD138+漿細(xì)胞呈多量浸潤(rùn)分布(EliVision法,×100)；F：E放大圖(×400)

3 討論

TA是一種以主動(dòng)脈及其主要分支受累出現(xiàn)狹窄、閉塞，或伴有動(dòng)脈瘤形成的慢性非特異性大血管炎[8]。TA病理標(biāo)本顯示主動(dòng)脈壁增厚不規(guī)則，內(nèi)膜增生，中膜和外膜纖維化收縮，伴有急性滲出性炎癥、慢性非特異性炎癥和各種肉芽腫性炎[9]，不同時(shí)期病理表現(xiàn)不同：急性期炎癥過(guò)程涉及血管壁的所有層，表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和多形核白細(xì)胞的積聚[10],中期表現(xiàn)為動(dòng)脈壁增生和外中膜和外膜內(nèi)炎癥過(guò)程的進(jìn)展,終末期則表現(xiàn)為彌漫性或結(jié)節(jié)性血管周圍纖維化，隨后管腔變窄[10-11],當(dāng)疾病快速進(jìn)展導(dǎo)致纖維化不足和延遲時(shí)，血管壁可能會(huì)變薄并導(dǎo)致動(dòng)脈瘤樣擴(kuò)張[10]。本研究TA血管病變主要表現(xiàn)為管壁的狹窄、閉塞,考慮這些患者病程均為疾病的中期或終末期。

有研究證實(shí),在組織學(xué)中可以看到TA動(dòng)脈管壁浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞15%為CD4+T細(xì)胞[12]，其作用是可以通過(guò)Th1釋放干擾素誘發(fā)和維持肉芽腫形成[13]。同時(shí),在活動(dòng)性TA動(dòng)脈外膜中發(fā)現(xiàn)了B細(xì)胞浸潤(rùn)[9],在外周血中也發(fā)現(xiàn)高于正常對(duì)照組的B細(xì)胞[14]，活動(dòng)性TA患者的B細(xì)胞活化因子水平(BAFF)升高，緩解期時(shí)BAFF循環(huán)水平下降[15]，利妥昔單抗治療TA有效[16]，這些證據(jù)均支持CD4+T細(xì)胞及B細(xì)胞在TA發(fā)病機(jī)制中的作用。在本研究所有TA標(biāo)本中均見(jiàn)到CD4+輔助T細(xì)胞和CD20+B細(xì)胞在動(dòng)脈壁中浸潤(rùn)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，且其中大部分患者輔助T細(xì)胞和B細(xì)胞均聚集成灶，有3例患者漿細(xì)胞也聚集成灶，并且此3例患者均處于TA活動(dòng)期，提示適應(yīng)性免疫反應(yīng)，包括體液免疫反應(yīng)參與了TA發(fā)病。

B細(xì)胞在自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的發(fā)病中起重要作用。Zhao等[17]提出，SLE中B細(xì)胞同時(shí)通過(guò)抗體依賴和非抗體依賴途徑發(fā)揮免疫作用。目前尚無(wú)TA相關(guān)自身抗體被發(fā)現(xiàn)，TA的發(fā)病是固有免疫成分異常激活，還是適應(yīng)性免疫反應(yīng)異常激活，尚無(wú)定論。本研究發(fā)現(xiàn)TA動(dòng)脈壁中有T細(xì)胞，B細(xì)胞和漿細(xì)胞的灶性浸潤(rùn)，提示B細(xì)胞在TA發(fā)病中可能發(fā)揮重要作用。B細(xì)胞除了活化形成漿細(xì)胞分泌自身抗體外，可能通過(guò)非抗體依賴途徑影響T細(xì)胞活化和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生而參與大動(dòng)脈壁內(nèi)炎癥反應(yīng)。TA動(dòng)脈壁IHC結(jié)果提示B細(xì)胞清除治療(B cell depletion therapy，BCDT)可能成為治療難治性TA患者的一種選擇。近年來(lái)越來(lái)越多使用BCDT成功治療難治性TA的研究均提示B淋巴細(xì)胞在TA生理病理學(xué)中的潛在作用[18-19]。

綜上所述，本研究提示除了T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫發(fā)病機(jī)制外，B細(xì)胞也參與TA發(fā)病，為BCDT治療難治性TA提供了證據(jù)。目前尚無(wú)TA相關(guān)自身抗體被發(fā)現(xiàn)，體液免疫在TA發(fā)病中的作用需要進(jìn)一步的研究。