張夢瑤，任建發(fā)，陳亞南，邸衛(wèi)英

1河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北保定071000

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病[1]包括腦膜炎(腦膜或脊膜的炎癥)、腦炎，是指由細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲等病原體引起的炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)最常見的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為發(fā)熱、頭痛，部分表現(xiàn)惡心、嘔吐、煩躁，甚至抽搐、昏迷等癥狀，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，除腦卒中外，腦(膜)炎致殘率排首位，致死率排第二位。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的病原學(xué)診斷主要依靠腦脊液涂片鏡檢、病原體培養(yǎng)、抗原抗體檢測、PCR檢測，具有早期難以診斷、治療效果不佳、預(yù)后差等特點(diǎn)，針對(duì)于此，臨床如何早診斷、早識(shí)別、早治療已成為研究的重點(diǎn)。宏基因組二代基因測序(mNGS)技術(shù)利用鳥槍測序原理，可以檢測出樣本中已存在的所有脫氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)信息，進(jìn)而分析整個(gè)微生物組及患者樣本中的人類基因組和轉(zhuǎn)錄組，得到致病微生物的信息[2]。腦脊液mNGS技術(shù)的應(yīng)用提高了中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的早期診斷率。目前關(guān)于腦脊液mNGS技術(shù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病診斷的應(yīng)用研究雖然不多，但也取得了一些進(jìn)展，現(xiàn)將腦脊液mNGS技術(shù)的特點(diǎn)及其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病診斷中的應(yīng)用進(jìn)展綜述如下。

1 mNGS技術(shù)的特點(diǎn)

目前中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的病原體鑒定方法有體液培養(yǎng)檢測、藥敏試驗(yàn)、抗原抗體檢測、涂片鏡檢和PCR。PCR是基于已知病原菌的基因組序列，雖然在敏感性、特異性和檢測時(shí)間上具有一定優(yōu)勢，但是所能提供的信息有限。mNGS技術(shù)是一種無偏倚的檢測方法，它不使用任何引物或探針進(jìn)行特異擴(kuò)增，可以對(duì)臨床樣本中的核酸直接地進(jìn)行高通量測序，陽性率在25%～50%，耗時(shí)1～3 d，可檢測10 000～20 000種微生物，故mNGS技術(shù)可以檢測新病原體，可以作為排除廣泛潛在中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病的合適工具，同時(shí)對(duì)于混合感染的檢測也具有重要作用；并且當(dāng)臨床表現(xiàn)不典型時(shí)會(huì)遺漏一些未考慮到的病原體，此時(shí)mNGS技術(shù)可以做出補(bǔ)充，降低漏診率；mNGS技術(shù)同樣適用于多種局灶性組織的檢測，并在疑似局灶性感染期間提供可靠的結(jié)果。對(duì)于難確診性感染，如不明原因發(fā)熱、常規(guī)臨床檢測反復(fù)陰性或未知病原體的鑒定方面，腦脊液mNGS也發(fā)揮著重要作用[3]。

與常規(guī)檢測方法相比，mNGS技術(shù)的陽性百分比一致性顯著高于常規(guī)方法和培養(yǎng)，進(jìn)而增加病原體的識(shí)別率。其原因如下：樣品收集前的抗菌處理會(huì)影響培養(yǎng)陽性率，而mNGS技術(shù)不會(huì)受影響[4]；mNGS技術(shù)的機(jī)制是檢測病原體片段，而培養(yǎng)需要活微生物，所以一些培養(yǎng)陰性的樣本，mNGS技術(shù)可在85.00%患者中獲得其余的病原學(xué)診斷。與常規(guī)培養(yǎng)和菌株鑒定相比，mNGS技術(shù)的時(shí)間消耗更短，因此mNGS技術(shù)可以用于輔助診斷培養(yǎng)率相對(duì)較低或周期較長的病原菌(如：細(xì)胞內(nèi)病原菌、分枝桿菌家族)。

對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，目前的常規(guī)檢測方法常常造成漏診、誤診，在不同的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病中，不同的檢測方法有各自的優(yōu)勢和劣勢，當(dāng)常規(guī)檢測無法給出明確的診斷，或者常規(guī)檢測的檢測結(jié)果與臨床表現(xiàn)不一致時(shí)，mNGS技術(shù)作為一項(xiàng)精準(zhǔn)的檢測方式，可以給出更加明確的結(jié)果，從而可以指導(dǎo)臨床。

在不同的感染中，mNGS技術(shù)的陽性結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)是不同的，制定標(biāo)準(zhǔn)的合理性直接影響結(jié)果的敏感性和特異性，進(jìn)而影響結(jié)果的判讀，甚至影響臨床診療。而當(dāng)實(shí)驗(yàn)中存在污染，或者感染的是一些特殊菌的時(shí)候，實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陰性，耽誤診療進(jìn)程，嚴(yán)重影響預(yù)后。對(duì)于細(xì)菌和病毒來說，陽性的標(biāo)準(zhǔn)是映射到一種微生物(物種水平)的讀數(shù)比任何其他微生物的讀數(shù)多10倍時(shí)；而真菌是指當(dāng)一種真菌的覆蓋率(種級(jí))比另一種真菌的覆蓋率大5倍時(shí)；結(jié)腦則是指至少有一個(gè)讀碼被映射到結(jié)核性腦膜炎細(xì)胞(MBTC)的種或?qū)偎絒5]。

CSF的mNGS技術(shù)有假陰性的情況。部分僅通過血清學(xué)檢查診斷的病例通過CSF進(jìn)行常規(guī)的直接檢測試驗(yàn)是陰性的；從除腦脊液以外的其他樣本中，如腦活檢中診斷出的mNGS陽性的病例容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果；由于腦脊液中病原體效價(jià)低而導(dǎo)致mNGS假陰性，如常規(guī)微生物學(xué)試驗(yàn)證明是陽性或結(jié)果不一致，包括牛分枝桿菌感染、結(jié)核分枝桿菌、隱球菌、痤瘡丙酸桿菌、梭形芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、巨細(xì)胞病毒和2型單純皰疹病毒；部分已檢測到遺漏的細(xì)菌和真菌病原體的讀圖，但其豐度太低，未達(dá)到預(yù)先確定的報(bào)告閾值，未在報(bào)告中呈現(xiàn)出來；當(dāng)高宿主背景的腦脊液樣本中有潛在致命的有機(jī)體時(shí)假陰性率也較高，自身免疫性腦炎的宿主背景較低易漏診。

2 mNGS技術(shù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病診斷中的應(yīng)用

對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病而言，mNGS技術(shù)已經(jīng)成為處理新興的傳染病暴發(fā)和傳染病的一流實(shí)驗(yàn)室方法；mNGS技術(shù)作為慢性和復(fù)發(fā)性腦炎的一線診斷試驗(yàn)和急性腦炎的二線試驗(yàn)；當(dāng)處于以下情況時(shí)，腦脊液mNGS技術(shù)應(yīng)被視為急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的一線檢查：①患者病情危重之時(shí)，需要及時(shí)并且精準(zhǔn)的治療；②臨床表現(xiàn)不是特異性的，并且使用許多針對(duì)靶標(biāo)特異性的檢測來確定感染原因；③需要排除廣泛的潛在病原體；mNGS技術(shù)與常規(guī)測試相結(jié)合可幫助排除懷疑自身免疫性腦炎患者的活動(dòng)性感染，這些患者通常有輕度至中度淋巴細(xì)胞多細(xì)胞增生癥；當(dāng)mNGS與常規(guī)測試的結(jié)果相一致時(shí)，mNGS技術(shù)的意義在于不但可以保證常規(guī)檢測的診斷是無誤的，也可能檢測或排除合并感染[6]，特別是對(duì)于免疫功能低下的患者。

2.1 mNGS技術(shù)在病毒性腦炎/腦膜炎診斷中的應(yīng)用 病毒性腦炎/腦膜炎的病原體檢測方法主要有腦脊液染色、抗原抗體檢測和PCR技術(shù)等方法。mNGS技術(shù)在檢測罕見的、新發(fā)現(xiàn)的或非典型的病原微生物中起著重要作用。2015年，德國利用NGS在腦中發(fā)現(xiàn)了松鼠博爾鈉病毒進(jìn)而確診了3例基底節(jié)腦炎感染病例，這是此病毒可以向人類傳染的第一個(gè)證據(jù)。2017年，復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院感染科張文宏教授團(tuán)隊(duì)，利用NGS技術(shù)在1例患有眼內(nèi)炎患者的玻璃體液中發(fā)現(xiàn)了偽狂犬病毒(PRV)[7]，這是首例證實(shí)PRV可以感染人類，并引起眼內(nèi)炎的病例。次年，由北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科關(guān)鴻志教授領(lǐng)導(dǎo)的多中心腦炎合作小組利用NGS技術(shù)報(bào)道了全球首例PRV導(dǎo)致人類腦炎的病例[8]，此腦炎協(xié)作組關(guān)于病原宏基因組學(xué)腦炎/腦膜炎的研究納入了來自20家醫(yī)院的276例腦炎或腦膜炎患者，主要是細(xì)菌和病毒，人類皰疹病毒3型，人類皰疹病毒1型，結(jié)核分枝桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和布魯菌，未涵蓋RNA病毒，mNGS陽性率達(dá)36.6%，同時(shí)Wilson等[9]團(tuán)隊(duì)在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)表了關(guān)于病原mNGS腦炎/腦膜炎臨床應(yīng)用多中心研究的文章，包括來自美國醫(yī)院的204例原發(fā)性腦炎、腦膜炎和脊髓炎患者，檢出結(jié)果以病毒為主，尤其檢出4例腸病毒，mNGS陽性率15.7%。

2.2 mNGS技術(shù)在細(xì)菌性腦膜炎診斷中的應(yīng)用 細(xì)菌性腦膜炎的傳統(tǒng)微生物學(xué)檢測方法多為外周血或腦脊液革蘭染色、血清學(xué)分型、病原菌的分離培養(yǎng)。2013年，Lavezzo等[10]對(duì)腦膜炎奈瑟菌爆發(fā)流行時(shí)感染患者的細(xì)菌分離物進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)NGS可以作為分子流行病學(xué)的補(bǔ)充，能夠很好地監(jiān)測感染性疾病的爆發(fā)。2014年，新英格蘭雜志報(bào)道了1例14歲先天性免疫缺陷的兒童，發(fā)熱、頭痛4個(gè)月后出現(xiàn)昏迷，常規(guī)檢測方法未發(fā)現(xiàn)病原體，NGS在腦脊液發(fā)現(xiàn)可疑感染的鉤端螺旋體序列，PCR和血清學(xué)測試均證實(shí)了結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)用青霉素G治療有效[11]，預(yù)測NGS將改變臨床實(shí)踐中檢測和鑒定病原體的能力。隨后mNGS技術(shù)先后檢測出以嗜鹽菌[12]、鏈球菌、不動(dòng)桿菌、假單胞菌、奈瑟球菌、布氏桿菌[13]、單核增生性李斯特菌[14]等一系列細(xì)菌性病原體，mNGS技術(shù)在臨床中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)菌感染的診斷中發(fā)揮著越來越重要的作用。

2.3 mNGS技術(shù)在結(jié)核性腦膜炎診斷中的應(yīng)用 結(jié)核性腦膜炎的常規(guī)腦脊液檢測方法有培養(yǎng)、AFB染色、Xpert MTB/RIF和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR；又稱 Sanger測序),常規(guī)檢查的檢出率很低，不到40%[15]，培養(yǎng)是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但需要耗時(shí)2～4周，且效率低(0～40%)[16]，AFB染色敏感性低，但它普遍可用，價(jià)格便宜，而且快速，允許重復(fù)檢測以提高敏感性。世界衛(wèi)生組織已正式建議Xpert MTB/RIF用于結(jié)核病診斷[17]，評(píng)估其對(duì)結(jié)核性腦膜炎診斷的敏感性約為60%[18]。王勝南等在研究中表明，mNGS技術(shù)的敏感性最高(66.67%)，其次是AFB染色法(33.33%)、PCR法(25%)和培養(yǎng)法(8.33%)。反復(fù)AFB使陽性檢出率提高到36.36%。mNGS技術(shù)檢測結(jié)果與總AFB的一致性為22.22%，與所有常規(guī)方法的一致性為44.44%。mNGS技術(shù)與常規(guī)方法相結(jié)合，使檢出率提高到95.65%。提示mNGS技術(shù)(78.26%)是檢測分支桿菌DNA最靈敏方法；mNGS技術(shù)可能被用作結(jié)核性腦膜炎診斷的一線診斷工具；mNGS技術(shù)與常規(guī)方法的結(jié)合將使檢測率最大化[5]。

特殊的是，基因檢測表明，在大多數(shù)情況下，映射到分枝桿菌核苷酸的讀數(shù)較少。分枝桿菌的檢測更為復(fù)雜，因?yàn)榉种U菌是細(xì)胞內(nèi)的病原體，在腦脊液中的豐度非常低。同時(shí)由于結(jié)核桿菌數(shù)量少，污染可能性低，建議結(jié)核桿菌檢測的截止值應(yīng)該設(shè)定得較低。

2.4 mNGS技術(shù)在隱球菌性腦膜炎診斷中的應(yīng)用 對(duì)于隱球菌性腦膜炎，目前臨床上常用檢測方法有腦脊液墨汁染色、培養(yǎng)及莢膜抗原測定。真菌培養(yǎng)耗時(shí) 2～4周，腦脊液陽性率為 62%，隱球菌難通過血腦屏障，血液陽性率僅8.6%～16%[19]。腦脊液墨汁染色敏感性高達(dá)90%[20]。隱球菌莢膜抗原測定敏感性及特異性為93%～100%[21]，但當(dāng)其超過100 μg /L時(shí)無法繼續(xù)滴度測定，且無法確定為哪種類型隱球菌感染。王芳等[22]發(fā)現(xiàn)，腦脊液隱球菌莢膜抗原檢測陽性率最高，其次是mNGS技術(shù)，墨汁染色次之，培養(yǎng)最差。

葛瑛等[23]指出，流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，我國隱球菌性腦膜炎主要按新型隱球菌治療，實(shí)際上新型隱球菌感染和格特隱球菌感染在疾病進(jìn)展和治療方案上存在明顯差異，HIV陰性患者中出現(xiàn)格特隱球菌者神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的比例更高，如腦組織多發(fā)性肉芽腫性損傷，其對(duì)抗真菌藥物的反應(yīng)差，必要時(shí)需進(jìn)行神經(jīng)外科手術(shù)干預(yù)。目前，通過以上幾種常用檢測方式均無法對(duì)二者進(jìn)行鑒別，mNGS技術(shù)則可有效區(qū)分二者。

3 mNGS技術(shù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病診斷中面臨的挑戰(zhàn)及解決方案

盡管mNGS技術(shù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病發(fā)揮著越來越重要的作用，但是其在應(yīng)用過程中仍然面臨著很多挑戰(zhàn)。①生物信息學(xué)挑戰(zhàn)：目前用于分析mNGS數(shù)據(jù)的用戶友好型生物信息軟件[24]尚不夠完善，建議更新公共數(shù)據(jù)庫，使用云平臺(tái)實(shí)現(xiàn)信息共享，以便臨床醫(yī)生加強(qiáng)溝通，推動(dòng)mNGS技術(shù)的臨床應(yīng)用，加速mNGS技術(shù)的發(fā)展。②成本過高：盡管序列數(shù)據(jù)的生成已大大降低了成本，但是用于測序的樣品試劑的總體成本仍然很高，由于mNGS技術(shù)采集腦脊液的時(shí)間可能與腦脊液中病原體出現(xiàn)的高峰時(shí)間不同，因此重復(fù)檢測mNGS技術(shù)可提高敏感性，但是成本過高會(huì)限制它的廣泛使用和重復(fù)檢測，并且大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室缺乏機(jī)器人設(shè)備、自動(dòng)化協(xié)議，過多的人工投入會(huì)增加成本。還有確保監(jiān)管而采取的生物信息學(xué)分析渠道會(huì)顯著增加成本，可以通過改進(jìn)硬件方面的技術(shù)，以提高通量降低成本，使用液體處理生物機(jī)器人來提高自動(dòng)化程度，開發(fā)用于NGS樣品庫制備的微流控設(shè)備來降低成本。③監(jiān)管復(fù)雜：mNGS技術(shù)的實(shí)驗(yàn)正常完成需要全程進(jìn)行質(zhì)量控制，包括初始樣品質(zhì)量檢查，庫參數(shù)(濃度和大小分布)，序列數(shù)據(jù)生成(簇密度和Q評(píng)分)，內(nèi)部控制的恢復(fù)和外部控制的執(zhí)行，每一步驟都需要確保無誤[2]，才能順利完成測序。④目前的試驗(yàn)結(jié)果可能有誤差：實(shí)驗(yàn)表明，目前多為單中心回顧性橫斷面研究，入選的患者可能在臨床分析過程中引入一些偏差;然而前瞻性臨床研究了解何時(shí)進(jìn)行mNGS，對(duì)成本控制更有益處，應(yīng)鼓勵(lì)臨床大夫多進(jìn)行前瞻性多中心研究。⑤樣本量的多少、樣本的污染和腦脊液的選取影響陽性率的結(jié)果：目前部分實(shí)驗(yàn)提供的樣本量較少，最終可能會(huì)影響陽性率等計(jì)算。對(duì)于樣本采集和(或)處理過程中的樣本污染，包括與背景污染相關(guān)的微生物，雖然實(shí)驗(yàn)結(jié)果達(dá)到了預(yù)設(shè)的mNGS陽性結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)，但與患者的臨床特征不符，這使得檢測的假陽性率增高。為了減少污染的潛在影響，我們?yōu)閙NGS陽性結(jié)果定義了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)臨床醫(yī)生應(yīng)該謹(jǐn)慎解釋當(dāng)mNGS陽性檢測結(jié)果為醫(yī)院常見的細(xì)胞外細(xì)菌或真菌，特別是當(dāng)在一次NGS檢測中檢測到多種細(xì)菌時(shí)，除此之外，病毒和寄生蟲的陽性mNGS技術(shù)檢測不太可能是假陽性；病毒和寄生蟲的陽性mNGS測試假陽性的可能性不大。其次我們還應(yīng)該嚴(yán)格控制工藝，采用單向作業(yè)、前置放大區(qū)域的正壓通風(fēng)和分隔不同測定步驟的工作空間；并且我們還可以通過標(biāo)準(zhǔn)化新試劑的質(zhì)量控制測試、定期擦拭儀器和實(shí)驗(yàn)室表面、連續(xù)追蹤看到的污染物來監(jiān)控污染[24]。部分研究檢測結(jié)果的陽性百分比一致性較低[9]，一部分原因是選取的有效腦脊液是暴露于經(jīng)驗(yàn)性抗生素或經(jīng)歷多次凍融循環(huán)之后，還有就是因?yàn)椴糠只颊呤寝D(zhuǎn)診，進(jìn)行mNGS之前已經(jīng)經(jīng)過治療，導(dǎo)致入組患者存在偏倚。囿于部分檢測工具的限制，部分樣本測序深度不夠，造成實(shí)驗(yàn)的敏感性較低，可以通過增加樣本測序深度，改善此問題。⑥當(dāng)前的數(shù)據(jù)庫可能會(huì)造成漏診，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果：mNGS技術(shù)能夠識(shí)別新病原體，但囿于參考數(shù)據(jù)庫的限制，并非所有病原體都可以被識(shí)別，造成漏診；并非患者均進(jìn)行RNA測序，可能遺漏罕見的感染病毒，如RNA病毒[4]，并且RNA非常容易降解，因此需要較高的檢測條件，在解讀RNA病原體報(bào)告時(shí)，有必要考慮樣品運(yùn)輸和實(shí)驗(yàn)室條件；因?yàn)樾枰獧z測的信息量較大，不可能列出報(bào)告中發(fā)現(xiàn)的所有病原體，對(duì)于罕見病原體、胞內(nèi)菌等，由于其序列較少且豐度較低，在報(bào)告中未列出，基于此，如果存在可疑的特定病原體的臨床感染，則可以追溯原始數(shù)據(jù)庫以進(jìn)行查詢。⑦當(dāng)檢測結(jié)果提示EB病毒(EBV)陽性時(shí)，還可能合并其他感染原因，容易造成誤診。尤其需要注意的是，當(dāng)檢測到某種病原體的DNA為陽性，但與患者的臨床表現(xiàn)和特征并不相符時(shí)，要高度警惕是否存在EBV感染。在當(dāng)前的研究中，一些患者的EBV呈陽性，但有其他更可能的感染原因，因?yàn)镋BV DNA經(jīng)常與其他微生物一起被檢測出來。

綜上所述，腦脊液mNGS技術(shù)作為一項(xiàng)精準(zhǔn)的檢測方式，對(duì)于檢測新病原體、提高檢測陽性率、降低漏診率和診斷難確診性感染起著重要作用，在病毒性腦炎/腦膜炎、細(xì)菌性腦膜炎、結(jié)核性腦膜炎和隱球菌性腦膜炎的診斷中起著不可替代的作用。但腦脊液mNGS技術(shù)在臨床應(yīng)用中，同樣也面臨著一些挑戰(zhàn)，包括生物信息學(xué)挑戰(zhàn)、成本過高、監(jiān)管困難、試驗(yàn)誤差、樣本問題以及漏診、誤診等。盡管mNGS技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用到臨床的時(shí)間并不久，但mNGS技術(shù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病中具有光明的前景，期待未來十年可獲得更多評(píng)估m(xù)NGS技術(shù)的臨床效用和成本效益的前瞻性臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)[25]。