周靚，唐軼珣，祝益民

湖南師范大學附屬第一醫(yī)院，長沙410002

心臟驟停(CA)是全球導致死亡的主要原因之一，美國每年約35萬人[1]、歐洲每年35萬～70萬人[2]死于心臟驟停。根據(jù)Zhang等[3]的報告,國內每年因CA而死亡的人數(shù)估計達54.4萬人。盡管目前心肺復蘇術(CPR)的實施有所增加、復蘇后治療有所改善，但CA的病死率仍較高，院外心臟驟停(OHCA)、院內心臟驟停(IHCA)患者的總存活率分別為9.6%、17%[4]。CA患者經CPR后恢復自主循環(huán)(ROSC)，但存活者可能會出現(xiàn)以腦損傷、心肌功能障礙、全身缺血再灌注損傷為主要表現(xiàn)的心臟驟停后綜合征(PCAS)[5]。因此，CA后器官損傷機制、相關病理生理過程及病因復雜，機制尚未完全闡明。代謝組學是繼基因、蛋白質、轉錄組學之后發(fā)展起來的一種新興的研究系統(tǒng)生物學的方式。代謝組學被認為是一種行之有效的系統(tǒng)方法來表征代謝表型，這是對于包括環(huán)境、藥物、飲食方式、生活習慣、遺傳、微生物等各種內在和外在參數(shù)的一個協(xié)調的生理反應的結果。CA的發(fā)生必然伴隨著代謝的改變，代謝組學是從小分子代謝物及其轉化途徑進行分析，使人們更深層次理解CA發(fā)生機制及過程，為靶向器官功能的復蘇與保護研究提供新的研究思路及方法。有研究表明，結合代謝組學分析有助于全面了解CA發(fā)病機制、早期診斷、疾病病情評估、預后及療效評估等[6]?，F(xiàn)對代謝組學在CA中的應用進展進行簡要綜述。

1 代謝組學概念及研究過程

早在1999年，由英國Nicholson教授領導的科研團隊正式提出代謝組學的概念：代謝組學是研究生物體在基因修飾下或受病理生理刺激后所有動態(tài)代謝產物的一門學科[7]，研究對象主要是細胞、組織或生物體液中內源性小分子代謝產物(<1 000 Da)。代謝組學研究過程通常為生物樣本采集、預處理、分離、檢測及鑒定，然后進行數(shù)據(jù)分析，進一步篩選生物標志物和分析代謝途徑。

代謝組學研究常用的檢測標本包括血液、尿液、膽汁、腦脊液、唾液、組織、細胞培養(yǎng)液和提取物等[8]，這些生物樣品中代謝產物的動態(tài)變化，能反映機體疾病狀態(tài)或健康狀態(tài)下的重要信息，在疾病診斷、微生物、植物及功能基因組等研究領域中發(fā)揮日益重要的作用[9]。代謝組學中最常見的分析技術主要包括核磁共振(NMR)、質譜(MS)、色譜、毛細管電泳、紫外線吸收、紅外光譜、放射性檢測、庫倫分析等[10]。由于代謝組學所分析的樣品種類、濃度、性質具有差異，沒有一種分析手段能檢測出所有種類的化合物，故應根據(jù)研究目的及樣本的性質來綜合應用多種技術平臺。通過代謝組學分析技術產生的大量原始數(shù)據(jù)，經過一系列的預處理后，可通過多元統(tǒng)計方法對數(shù)據(jù)加以整合后從中獲取所需的生物學信息，包括生物表型及標志物等信息。

2 代謝組學技術在CA中的應用

2.1 代謝組學技術在明確CA病因中的應用 引起CA的病因眾多，包括心臟、呼吸、循環(huán)、代謝、中毒、環(huán)境等。有研究表明，CA病因不同，其病理生理機制、組織損傷、復蘇后器官功能障礙和對治療的反應有顯著差異。CA發(fā)生的原因常由臨床醫(yī)生根據(jù)患者既往史、發(fā)病情況、臨床表現(xiàn)、輔助檢查等作出判斷。然而，在無第一目擊者情況下，患者突發(fā)CA，特別是在進行CPR時，明確其病因常十分困難。因此早期識別其病因以指導有效的后續(xù)治療尤為重要。

Varvarousis等[11]通過高分辨核磁共振氫譜(1H-NMR)和液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)在研究窒息致心臟驟停(ACA)和心室顫動致心臟驟停(VFCA)兩種不同病因的CA豬模型中發(fā)現(xiàn)，兩者代謝指紋在驟停和復蘇階段顯著不同：ACA組在窒息期和驟停期表現(xiàn)出明顯的代謝紊亂，而VFCA組這種現(xiàn)象在復蘇階段發(fā)生變化。三羧酸循環(huán)、尿素循環(huán)發(fā)生了代謝紊亂，CA預后不良的生物標志物為琥珀酸的高表達。因此，琥珀酸可為OHCA患者或法醫(yī)提供重要的臨床信息，并有助于確定CA的病因。Locci等[12]應用高分辨1H-NMR代謝組學技術，研究CA各階段的不同代謝特征，發(fā)現(xiàn)在CA期間，三磷酸腺苷(ATP)的消耗導致肌苷增加，無氧糖酵解加速使琥珀酸增加，琥珀酸和肌苷為窒息性CA的生物標志物。由于國內外關于CA病因的代謝組學研究較少，隨著代謝組學技術的飛速發(fā)展，將有更多學者致力于使用代謝組學方式從病因方面深入研究CA。

2.2 代謝組學技術在CA器官損傷與保護中的應用

2.2.1 CA腦損傷與保護的代謝組學研究 CA后造成的腦損傷是其高致殘率、高病死率的主要原因。大腦獨特的脆弱性是由于它對缺血的耐受性有限，以及對再灌注的獨特反應。CA后引起的腦損傷機制復雜，包括興奮性毒性、鈣穩(wěn)態(tài)紊亂、自由基形成、病理性蛋白酶級聯(lián)反應和細胞死亡信號通路激活等[13]。腦缺血、缺氧病理狀態(tài)下可導致器官、組織及細胞的能量代謝、糖代謝、氨基酸代謝及脂類代謝發(fā)生紊亂，通過代謝組學分析健康狀態(tài)與CA后的差異代謝物，可對CA致腦損傷進行預后評估。

大腦是葡萄糖代謝最旺盛的組織，其儲備的能量代謝底物較少。因此，大腦對缺血缺氧非常敏感。Baranovicova等[14]通過NMR代謝組學技術分析大腦血液停止后的代謝組學變化，結果顯示，由于缺血性損傷，糖酵解途徑受到干擾，導致酮體(丙酮、乙酰乙酸和β-羥基丁酸)水平增加、糖酵解產物含量下降。這與腦氧供停止后無氧代謝增加相關。有研究顯示，CA后腦組織內糖酵解和三羧酸循環(huán)代謝物減少(如1,6-二磷酸酯果糖、3-磷酸甘油酸和檸檬酸)[15]。另有研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖代謝相關物質與窒息后的氧化應激相關[16]，該研究對窒息新生兒尿液的代謝組學研究發(fā)現(xiàn)，尿中有機酸升高與神經發(fā)育結局顯著相關，并且與氧化應激有關，有高度敏感性和特異性。其中丙二酸乙酯、3-羥基-3-戊二酸甲酯與良好的神經發(fā)育有關，而戊二酸、丙二酸甲酯、3-羥基丁酸等則與預后不良有關。在新生窒息的仔豬模型中，使用1H-NMR進行尿液的代謝組學研究發(fā)現(xiàn)，代謝變異與缺氧水平相關，主要是由于尿素、肌酐、丙二酸、甲基胍、羥基異丁酸的差異顯著[17]。Kim等[18]在心臟驟停-體外循環(huán)(CPB)復蘇大鼠模型中，通過GC-MS和LC-MS/MS檢測大鼠心臟和腦組織中的非靶向代謝產物，發(fā)現(xiàn)在CA期間，心臟和腦組織中脂類和碳水化合物代謝產物水平有顯著變化，而在進行CPB復蘇后，僅在腦組織中發(fā)現(xiàn)糖酵解受損和溶血磷脂增加，這表明能量代謝改變和磷脂降解可能是無法成功復蘇大腦的原因之一。有研究發(fā)現(xiàn)，乳酸和丙酮酸可作為神經功能和預后的預測指標[19]。針對CA后腦組織損傷的治療中，被公認為有效的治療方式是亞低溫[20]，目前尚無藥物干預措施為CA患者提供神經保護。Wang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，二氯乙酸治療可增強CA大鼠模型丙酮酸脫氫酶活性，促進丙酮酸進入三羧酸循環(huán)，增加ATP的生成、降低乳酸和丙酮酸水平，同時會降低腦海馬和皮質中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素1β(IL-1β)的表達，可改善大鼠存活率及神經功能障礙。這一研究可為新的藥物改善CA患者腦神經功能缺損提供新視角。

從食物中吸收的氨基酸，在糖代謝中分解，一類用于合成輔酶A和參與三羧酸循環(huán)，然后迅速轉運至大腦中儲存；另外一類氨基酸則作為神經遞質和神經調質，參與大腦神經信息的傳遞。在Hua等[22]研究中發(fā)現(xiàn)，CA后誘導低溫減輕并延遲腦脊液中谷氨酸增加，有助于神經功能的保護。已有研究表明，通過抑制Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ的活性，減少谷氨酸信號的傳導，可保護幸存的神經元免受功能性重塑，并降低行為學習缺陷[23]。Hsu等[24]研究顯示，由組氨酸-色氨酸-酮戊二酸組成的氨基酸緩沖液通過維持升高缺氧誘導因子1α(HIF-1α)水平、抑制procaspase-3活化和降低煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶-4(NOX4)表達，保護CA后大鼠的神經功能。

脂質作為膜、生物能原料和信號分子的基本組成部分參與機體的生命活動。而大腦是人體脂質含量最高的器官。通過對脂質的分析可發(fā)現(xiàn)人類健康和疾病的生物標志物。研究顯示，與氨基酸庫不同，大腦中的脂肪酸池保持相對正常，在CA 20 min后，亞油酸顯著降低[15]。Kim等[25]發(fā)現(xiàn)，CA后進行CPB復蘇的大鼠腦損傷與磷脂或其氧化修飾的減少無關，而溶血磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰膽堿僅在大腦中顯著增加，表明磷脂代謝受損可能與缺血性腦損傷的嚴重程度相關。Anthonymuthu等[26]對CA患者行血漿腦特異性心磷脂靶向脂質組學研究，篩選出心磷脂(70∶5)可作為預測腦損傷嚴重程度和預后的標志物。

2.2.2 CA心臟損傷與保護的代謝組學研究 CA發(fā)生后，機體處于嚴重的全身缺血缺氧狀態(tài)，經實施CPR后，患者恢復了自主循環(huán)后出現(xiàn)再灌注損傷。與急性心肌梗死所致的局部心肌頓抑不同，CA后心肌功能障礙是全身循環(huán)完全停止后所致的全身性心肌頓抑的一種特殊類型[27]。有研究表明，ROSC后的心肌損傷是患者早期死亡的重要原因[28]。代謝組學技術以獨特的優(yōu)勢能反映CA-CPR后所引起體內代謝物的動態(tài)變化，更深入探討CA后心肌損傷病理機制，以期提高對CA患者的救治成功率。

Shibayama等[29]在離體犬CA模型中，通過GC-MS技術研究了長時間室顫致CA后早期電衰竭的代謝物改變，研究顯示糖酵解代謝增強導致乳酸堆積，這是電抑制和心臟停搏的關鍵代謝決定因素，室顫發(fā)生后出現(xiàn)的能量失衡程度決定糖酵解的速率。另外，無機焦磷酸鹽可防止缺血早期線粒體膜電位丟失和電衰竭，兩種保護作用之間的聯(lián)系可能與線粒體ATP水解速率降低和乳酸堆積相關。這項研究闡明了長時間室顫惡化致CA的病理生理學機制。

Tsai等[30]采集恢復了自主循環(huán)的IHCA患者血清樣本，研究顯示支鏈氨基酸與胰島素抵抗有關，可能會增加冠狀動脈粥樣硬化性心臟病和隨后心血管事件發(fā)生的風險，丙氨酸與心臟手術中的缺血再灌注損傷有關，因此支鏈氨基酸和丙氨酸成為潛在的預測IHCA患者預后的生物標志物。

脂肪酸是心肌的主要能量來源之一，在心肌缺血時脂肪酸代謝受到抑制，非酯化脂肪酸顯著升高[31]。Kim等[25]在大鼠CA-CPB復蘇模型中研究發(fā)現(xiàn)，無論是CA后，還是復蘇成功后，心臟的總磷脂含量并無明顯變化，而各組成成分發(fā)生改變，如溶血磷脂酰肌醇在CA期間顯著增加，經CPB復蘇后降低，但其他溶血磷脂種類無明顯變化。這種獨特反應表明，磷脂酰肌醇代謝對缺血和復蘇所改變的細胞狀況高度敏感。

2.2.3 CA腎臟損傷與保護的代謝組學研究 CA時間較長或復蘇后腎臟持續(xù)的低灌注，易發(fā)生急性腎損傷，甚至迅速發(fā)展為急性腎衰竭，病死率較高。目前，臨床上腎損傷惟一可靠的檢測指標是血肌酐和尿量。但是，血肌酐和尿量并不是最感敏的指標，容易受多種外在因素的影響。通過代謝組學研究CA后腎臟組織代謝譜的演變規(guī)律，可為腎臟損傷尋找新的診斷、治療方法提供研究線索。

目前，關于CA后的腎臟代謝改變文獻較少。Kim等[25]研究發(fā)現(xiàn)，復蘇后腎臟氨基酸和脂肪酸代謝物減少，而三羧酸循環(huán)代謝物顯著增加。腎臟中氨基酸代謝呈現(xiàn)出一種失調模式，惟一不受CA影響的是谷氨酰胺、蘇氨酸、丙氨酸和纈氨酸，其余的氨基酸則顯著減少；復蘇后顯示有更多的代謝紊亂，除谷氨酸、丙氨酸和纈氨酸外，所有測定的氨基酸均顯著減少。脂質代謝總體趨勢：缺血期間，腎臟組織中的脂質增加，如棕櫚酸和硬脂酸顯著增加；復蘇后血流恢復，脂質多恢復至正常水平或降低，如硬脂酸趨于正?；?，而亞油酸和亞麻酸降低。糖酵解和三羧酸循環(huán)代謝物的變化如下：在CA后3-磷酸甘油酸和酮戊二酸顯著升高；然而，CPB復蘇后檸檬酸、酮戊二酸、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸和草酰乙酸等顯著增加。

綜上所述，盡管通過代謝組學技術，可找出CA后不同器官的差異性代謝物，但諸多研究者并未深層次地研究這些代謝產物在CA后器官損傷中的致病機制，亦未能探討不同代謝產物間是否有關聯(lián)。CA后不同器官的差異代謝產物不同，有可能與檢測技術、不同物種等因素有關，但更可能與器官的代謝模式相關，同一代謝物對應的器官損傷可能不一樣。因此，通過代謝組學技術描繪特定器官的代謝指紋，有助于靶向器官功能的復蘇與保護?；颊叩膹吞K成功首先取決于自主循環(huán)恢復，其次取決于代謝途徑受損的正?；?。然而，除了初級代謝改變之外，各種次級代謝改變繁雜，如何在這么多改變的代謝產物中發(fā)現(xiàn)關鍵的標志物，更具有挑戰(zhàn)性。