石亞群，俞妍慧

(1.長治醫(yī)學(xué)院 研究生院，山西 長治；2.長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院 血液科，山西 長治)

0 引言

CARs由細(xì)胞外抗原結(jié)合域(通常是來自單克隆抗體的單鏈可變片段(ScFv))和細(xì)胞內(nèi)信號域(通常是TCR-CD3ζ鏈)組成[1]。雖然針對T細(xì)胞的CARs技術(shù)已廣泛用于臨床，但對CAR-NK細(xì)胞的研究很大程度上仍處于臨床前階段。然而，CAR-T細(xì)胞在淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤中的不良反應(yīng)及其針對實體腫瘤的局限性[2]推動了CAR-NK細(xì)胞用于臨床的進(jìn)一步研究。

1 NK細(xì)胞分類及其優(yōu)勢

自然殺傷細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，NK細(xì)胞通過基因編碼的抑制性和激活性受體提供的信息來區(qū)分自體健康細(xì)胞及外來的、受感染的或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在血液中，細(xì)胞毒性CD56dimNK細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)CD56brightNK細(xì)胞構(gòu)成了NK細(xì)胞的兩個主要群體。與T細(xì)胞相比，NK細(xì)胞具有以下優(yōu)勢：NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用不受HLA限制；同種異體半相合NK細(xì)胞不會引起移植物抗宿主病[3,4]；減少了CAR靶向抗原丟失所致的復(fù)發(fā)或耐藥性風(fēng)險[5,6]；此外，巨細(xì)胞病毒誘導(dǎo)的記憶樣適應(yīng)性NK細(xì)胞已被證明是長壽和高效的[7]。綜上所述， NK細(xì)胞的安全性與抗腫瘤能力的結(jié)合使其成為CAR技術(shù)實施的一顆新星，通過基因修飾引入抗原特異性來增強(qiáng)NK細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)是目前腫瘤免疫領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。

2 NK細(xì)胞來源

2.1 NK細(xì)胞系(NK-92)

目前大多數(shù)CAR-NK細(xì)胞研究都是用NK-92細(xì)胞進(jìn)行的，NK-92細(xì)胞最初來源于非霍奇金淋巴瘤患者中，其在IL-2的作用下激活增殖，在保持一致表型和功能特征的同時可大量擴(kuò)增[8]。然而，NK-92細(xì)胞表面缺乏抑制性殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIR) 及CD16的表達(dá)，因此不能通過抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)殺傷靶細(xì)胞。通過基因工程將高親和力的CD16受體嵌合到NK-92細(xì)胞中有效解決了上述問題，以通過ADCC促進(jìn)腫瘤消除[9]，但與CD16結(jié)合的腫瘤特異性單克隆抗體可能會受到患者體內(nèi)IgG的競爭性結(jié)合。最近，將NK-92細(xì)胞與第四代CAR結(jié)構(gòu)結(jié)合，稱為UniCAR[10]。UniCAR由針對多肽表位E5B9的胞外單鏈片段可變區(qū)、CD28跨膜和胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域及CD3ζ胞內(nèi)信號域組成，經(jīng)修飾表達(dá)UniCAR的NK-92細(xì)胞可通過被稱為靶模塊(Testination Module，TM)的雙特異性靶分子重定向到腫瘤細(xì)胞。與表達(dá)CD16的NK-92細(xì)胞相比，UniCAR NK-92細(xì)胞只被攜帶E5B9肽表位的TM激活，提供了更高水平的選擇性和特異性。此外，通過同時或順序使用不同的TM，可將相同的CAR-NK細(xì)胞重定向到不同的靶細(xì)胞，從而實現(xiàn)了其針對靶抗原的高度靈活性[10]。盡管NK-92細(xì)胞受到較高的關(guān)注度，但因NK-92細(xì)胞來自淋巴瘤且有可能感染EB病毒，這使得細(xì)胞在輸注前必須進(jìn)行照射[11]。大量研究表明，NK-92細(xì)胞在照射后仍保持其細(xì)胞毒性，但降低了其在體內(nèi)的增值性[12]，需通過多次輸注進(jìn)行治療。

2.2 臍血NK細(xì)胞

NK細(xì)胞的另一來源是臍帶血(CB)，15%-30%的CB淋巴細(xì)胞是NK細(xì)胞，通常認(rèn)為它們在表型和功能上比外周血(PB)NK細(xì)胞更幼稚。CD16、顆粒酶B、穿孔素和殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIR)在臍血NK細(xì)胞中的表達(dá)性降低，細(xì)胞粘附分子CD2、CD11a、CD18和CD62L的表達(dá)也降低。有限的ADCC潛能和粘附分子的減少導(dǎo)致了臍血NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性能力降低[13,14]。較高比例的臍血NK細(xì)胞是CD56bright，這導(dǎo)致抑制性受體NKG2A的總體表達(dá)增加，該受體的配體HLA-E通常在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)上調(diào)，這與腫瘤預(yù)后不良相關(guān)[15]。因此，NKG2A是一個重要的免疫檢查點(diǎn)，在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生過程中，NKG2A已成為單克隆抗體治療的靶點(diǎn)，以促進(jìn)NK細(xì)胞殺傷腫瘤的潛能[16]。與其未成熟特性相一致的是，臍血NK細(xì)胞具有較高的增殖能力，并且容易接受細(xì)胞因子的刺激。雖然臍帶血庫使臍血來源的NK細(xì)胞成為一種可行的起始產(chǎn)品，但從臍帶血中獲得的少量NK細(xì)胞需經(jīng)多次細(xì)胞分裂，才能獲得足夠的細(xì)胞數(shù)量以供輸注[13]。盡管如此，臨床上的CAR-NK細(xì)胞產(chǎn)品已經(jīng)有來源于臍血NK細(xì)胞的，目前正在臨床上進(jìn)行測試[17]。

2.3 外周血NK細(xì)胞

大約90%的外周血NK細(xì)胞是具有細(xì)胞毒性的CD56dimNK細(xì)胞，表達(dá)大量的抑制性和激活性受體。與臍血NK細(xì)胞相比，外周血NK細(xì)胞更成熟，其功能更強(qiáng)，但增殖能力降低[18]。無論是在自體還是同種異體情況下，即NK細(xì)胞來自HLA匹配或不匹配的供者，以及KIR配體匹配或不匹配的供者，它作為一種過繼細(xì)胞治療產(chǎn)品的安全性已通過了大量臨床試驗的證明[19,20]。使用來自異體且HLA不匹配的外周血NK細(xì)胞的臨床試驗特性大大增加了可供選擇的捐贈者數(shù)量。將NK細(xì)胞分離是一種從健康捐贈者血液中提取有核細(xì)胞的方法，它有助于分離足夠數(shù)量的NK細(xì)胞，在輸注之前，通常會將這些細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)增，并用IL-2或IL-15等細(xì)胞因子將其激活。雖然其在血液系統(tǒng)惡性腫瘤(主要是急性髓系白血病)的臨床結(jié)果很有希望，但臨床反應(yīng)因患者而異，其臨床前的體外研究很難預(yù)測臨床試驗結(jié)局。

2.4 IPSC來源的NK細(xì)胞

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (induced pluripotent stem cells，iPSC)來源的NK細(xì)胞是CAR-NK細(xì)胞產(chǎn)品的理想來源，因為其具有無限增殖的潛力[21]，只需要一個CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的IPSC細(xì)胞就可以產(chǎn)生通用的現(xiàn)成CAR-NK細(xì)胞產(chǎn)品。然而，IPSC來源的NK細(xì)胞的研究現(xiàn)處于初級階段，仍需克服許多挑戰(zhàn)才能生產(chǎn)出理想的現(xiàn)成產(chǎn)品。IPSCs通常來源于非造血細(xì)胞，與外周血NK細(xì)胞相比，其產(chǎn)生的NK細(xì)胞具有CD16、KIR低表達(dá)，NKG2A高表達(dá)的未成熟表型[22,23]。這就提出了一個問題，即當(dāng)遇到靶細(xì)胞時，它們的細(xì)胞溶解能力是如何保持和釋放的，與NK-92細(xì)胞類似，通過基因工程使IPSC來源的NK細(xì)胞表達(dá)缺乏的表面蛋白(如CD16)是解決這一挑戰(zhàn)的有效方案。雖然它們的增殖能力是無與倫比的，但輸注后的持久性問題仍然存在，在IPSC來源的NK細(xì)胞的潛力被激發(fā)之前這些挑戰(zhàn)都需得到解決[24]。第一個IPSC衍生的CAR-NK細(xì)胞產(chǎn)品(FT596)表達(dá)CD19-CAR結(jié)構(gòu)、高親和力的CD16Fc受體及IL-15受體融合蛋白，并與CD20導(dǎo)向的單克隆抗體聯(lián)合應(yīng)用于實驗中。該產(chǎn)品不僅解決了IPSC來源的NK細(xì)胞有限的持久性及CD16低表達(dá)問題，同時還進(jìn)行了聯(lián)合免疫治療試驗，其在CD19+淋巴瘤的人源化小鼠的研究中取得了令人振奮的臨床前研究結(jié)果，這為最近開始的I期臨床試驗(NCT04245722)鋪平了道路。

3 CAR-NK細(xì)胞的臨床試驗

目前ClinicalTrials數(shù)據(jù)庫收集了12項關(guān)于CAR-NK細(xì)胞的試驗，其中6項在積極招募中，6項I期臨床試驗尚未積極招募。關(guān)于CAR-NK細(xì)胞的試驗主要集中在淋巴瘤和白血病上，其次是針對實體腫瘤的，包括卵巢癌、前列腺癌、腦癌、肝癌、肺癌和胰腺癌。使用NK-92和初級靶向CD33或NKG2D的CAR-NK細(xì)胞的小規(guī)模臨床試驗(n=3)結(jié)果已被報道[25,26]，而在最近才發(fā)表出一項大規(guī)模的I/II期臨床試驗結(jié)果[17]。11例CD19陽性的復(fù)發(fā)難治性慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)或非霍奇金淋巴瘤患者在接受標(biāo)準(zhǔn)的環(huán)磷酰胺/氟達(dá)拉濱去淋巴治療后，接受了臍血來源的CAR-NK細(xì)胞產(chǎn)品，其中8例患者(73%)得到緩解，7例(4例淋巴瘤，3例CLL)獲得完全緩解，1例Richter’s轉(zhuǎn)化的CLL獲得部分緩解，并且沒有出現(xiàn)細(xì)胞因子釋放綜合征、神經(jīng)毒性、移植物抗宿主病等不良反應(yīng)。在此試驗中，盡管輸注的NK細(xì)胞和受體之間存在嚴(yán)重的HLA不匹配，但輸注的CAR-NK細(xì)胞仍然擴(kuò)張，并持續(xù)存在至少12個月，IL-15的加入可能在這些CAR-NK細(xì)胞的持久性和抗腫瘤活性中發(fā)揮了重要作用。

4 CAR-NK細(xì)胞的挑戰(zhàn)

目前，CAR-NK細(xì)胞在臨床的實施主要受到三個因素的限制，即NK細(xì)胞對基因工程的抵抗；NK細(xì)胞有限的增殖能力；輸注后的持久性有限。(1) 用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒對原代NK細(xì)胞進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率很低，因此對NK細(xì)胞進(jìn)行非病毒轉(zhuǎn)染方式(DNA或mRNA質(zhì)粒的電穿孔)[27]受到了關(guān)注，但電穿孔在CAR構(gòu)建體中只是瞬時表達(dá)，因此不是穩(wěn)定的CAR-NK細(xì)胞基因工程產(chǎn)物的可行方法。現(xiàn)其他非病毒轉(zhuǎn)染方式即DNA轉(zhuǎn)座子[28]及靶向基因整合[29]的研究有望解決這一挑戰(zhàn)。(2)目前NK細(xì)胞的擴(kuò)增通常依賴于超生理水平的細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，通過將IL-15、IL-12和IL-18相結(jié)合，已經(jīng)從小鼠和人NK細(xì)胞中獲取到細(xì)胞因子誘導(dǎo)的記憶樣NK細(xì)胞，其表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗腫瘤反應(yīng)性和持久性[30,31]。但I(xiàn)L-15可導(dǎo)致NK細(xì)胞在體外擴(kuò)增時對細(xì)胞因子成癮，且呈劑量依賴性，因此當(dāng)輸注擴(kuò)增的初級NK細(xì)胞產(chǎn)品時，需要考慮細(xì)胞因子成癮問題[32]。(3)延長CAR-NK細(xì)胞持久性的一種方法是給予全身細(xì)胞因子支持，以誘導(dǎo)體內(nèi)輸注產(chǎn)品的增殖，雖然IL-2和IL-15已經(jīng)在臨床試驗中進(jìn)行了測試，但兩者都會導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用[33]。

5 結(jié)語

CAR-T細(xì)胞治療淋巴瘤的臨床成功促進(jìn)了CAR-NK細(xì)胞領(lǐng)域的快速發(fā)展。FDA批準(zhǔn)的第一個轉(zhuǎn)基因細(xì)胞產(chǎn)品為CAR-NK細(xì)胞的臨床應(yīng)用鋪平了道路，但簡單地將針對T細(xì)胞的優(yōu)化結(jié)構(gòu)整合到NK細(xì)胞中并不是最理想的，且導(dǎo)致細(xì)胞活化的生物學(xué)分子機(jī)制在T細(xì)胞和NK細(xì)胞之間有很大的差異，因此需進(jìn)一步考慮如何設(shè)計CAR-NK細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。新方法的開發(fā)和現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)化將促進(jìn)對原代NK細(xì)胞進(jìn)行更有效的基因工程改造，使新一代NK細(xì)胞能夠取代目前正在臨床上測試的NK-92細(xì)胞產(chǎn)品。最后，無論是進(jìn)一步開發(fā)基因構(gòu)建工程，還是尋找最佳NK細(xì)胞來源，如果能夠解決持久性問題，CAR-NK療法作為一種新的抗癌免疫療法將具有巨大的潛力。