顏春魯 安方玉 劉永琦 蘇 韞 張利英 李佳蔚王彩霞 王統(tǒng)香 王國文 李孟翰

1（甘肅中醫(yī)藥大學 蘭州730000）

2（甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學與中醫(yī)藥防治研究省級重點實驗室 蘭州730000）

3（敦煌醫(yī)學與轉化教育部重點實驗室 蘭州730000）

隨著重離子（12C6+）放療技術在臨床腫瘤治療中的廣泛應用，其對腫瘤病灶周圍正常組織產生的輻射損傷效應也日益受到研究者的關注。這種輻射損傷效應主要表現(xiàn)為DNA 損傷、細胞增殖或凋亡、基因表達改變、表觀遺傳學改變、炎癥反應、致瘤性轉化，甚至癌癥形成等［1-3］。因而探明重離子輻射旁效應累及組織細胞、旁器官規(guī)律、發(fā)生機制及如何防治這種輻射損傷效應等具有重要意義。中藥以低毒、高效、多靶點和整體調制等優(yōu)勢成為輻射防護研究的熱點［4-6］。摘自《醫(yī)學心悟》中的經方黃芪湯，主要由黃芪、熟地、麥冬、人參、枸杞子和五味子組成，全方具有益氣滋陰，生津養(yǎng)血之效。本實驗旨在探討黃芪湯對12C6+離子束輻射所致大鼠腦損傷的保護作用及其機制，為臨床輻射損傷的防護提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級Wister大鼠50只，體質量（180±20） g雌雄各半，購自甘肅中醫(yī)藥大學科研中心，實驗動物質量合格證號為SCXK（甘）2018-0005，所有動物自由飲水、攝食1 周。本實驗經通過甘肅中醫(yī)藥大學科研中心實驗動物倫理委員會的嚴格審查。

1.2 主要試劑

反轉錄試劑盒和實時熒光定量試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，批號分別為：H7806580、H7825350）；β-actin、Bcl-2、Bax、Caspase-3等引物 基 因 序 列 為： β -actin 上 游 引 物 5'-TGTGACGTTGACATCCGTAAAG-3'，Size：22，下游引物5'-GGCAGTAATCTCCTTCTGCATC-3'，Size：25，片段長度105 bp；Bcl-2 上游引物5'-CTTCTTCCAGATGGTGAGTGAG-3'， Size： 22，下游引物5'-GTGGATGACTGAGTACCTGAAC-3'，size：22，片段長度125 bp ；Bax 上游引物5'-GATGGCCTCCTTTCCTACTTC-3'，size：21，下游 引 物 5'-CTTCTTCCAGATGGTGAGTGAG-3'，size：22，片段長度96 bp；Caspase-3 上游引物5'-CTTGGAAAGCATCCAGCAATAG-3'， size： 22，下游引物5'-ACTCAGCACCTCCATGATTAAG-3'，size：22，片段長度122 bp（上述引物均由TaKaRa 寶生物工程（大連）有限公司設計并合成）；兔抗大鼠Bcl-2 抗體（美國Gene Tex 公司，批號：42970）；兔抗大鼠Bax 抗體（美國Gene Tex 公司，批號：39988）；兔抗大鼠Caspase-3 抗體（美國Gene Tex公司，批號：42753）；GAPDH抗體（美國Gene Tex公司，批號：41323）。

1.3 藥物及給藥劑量

黃芪湯方中的所有藥材均購自甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，中藥原藥材均由本校甘肅省高校中藏藥化學與質量研究室進行質量鑒定。黃芪湯由30 g黃芪、15 g熟地、15 g麥冬、15 g人參、15 g枸杞子和10 g五味子組成，人的臨床用量為100 g/d，按照人與大鼠的體表面積換算法得出劑量（100 g×0.018×5=9.0 g/(kg·d)）作為中劑量，則黃芪湯高、中、低劑量分別為18.0 g/(kg·d)、9.0 g/(kg·d)、4.5 g/(kg·d)。

1.4 主要儀器

美國Q5000 超微量紫外可見分光光度計（上海在途生物科技有限公司）；PCR熱循環(huán)儀（上海旦鼎國際貿易有限公司）；7500 型實施熒光定量PCR 擴增儀（上海興曼生物科技有限公司）；Western-blot 分析儀（BIO-RAD）；BX53 型光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.5 動物分組及處理

SPF 級Wister大鼠自由飲水、攝食1 周后，按隨機數字表法分為正常對照組，單純輻射模型組，黃芪湯高、中、低劑量組，每組10 只。正常對照組和單純輻射模型組給予等量生理鹽水灌胃，黃芪湯高、中、低劑量組給予黃芪湯灌胃（劑量為18.0 g/(kg·d)、9.0 g/(kg·d)、4.5 g/(kg·d)），連續(xù)7 d。第8 天腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉各組大鼠，除正常對照組大鼠外，其余各組大鼠腦部均給予4 Gy12C6+離子束單次照射。重離子照射是在中國科學院近代物理研究蘭州重離子加速器研究裝置的淺層腫瘤治療終端上所完成的，照射過程中的束流為12C6+離子束，具體照射方法參考文獻［5］，采用坪區(qū)照射，照射過程中的能量為165 MeV，LET 為20 keV/μm，吸收劑量率為4 Gy/min，用空氣電離室監(jiān)測劑量，照射劑量為4 Gy。輻射后第7天稱量各組大鼠的體質量，股動脈采血，處死大鼠，分離血清，摘取腦組織備用。

1.6 動物體質量及腦系數測定

輻射后第7天稱量各組大鼠體質量，股動脈采血處死各組大鼠，用生理鹽水沖洗腦組織并用吸水紙吸干后稱重，計算大鼠的腦系數。大鼠腦系數（mg/g）=腦質量（mg）/大鼠體質量（g）。

1.7 腦組織病理改變觀察

稱重后的腦組織用手術刀片做冠狀腦切片后放在4%多聚甲醛固定液中24 h，梯度乙醇脫水后二甲苯處理及常規(guī)石蠟包埋，60 ℃過夜后脫蠟、沖洗、蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察腦組織結構改變。

1.8 腦組織神經細胞凋亡測定

將適量腦組織制作冰凍腦片后用TUNEL 試劑盒進行染色，抗熒光猝滅封片液封片后在顯微鏡下觀察切片，隨機各選擇5 個×100 視野區(qū)域，每個視野區(qū)域至少包含30 個細胞；使用Image proplus 6.0 軟件分析對每個視野范圍內的總細胞個數和凋亡細胞個數進行計數。細胞凋亡百分率（%）=凋亡細胞數目/總細胞數目×100%。

1.9 腦組織Bcl-2、Bax和Caspase-3基因表達測定

腦組織RNA 提取用4 ℃的Trizol 試劑，提取后立即上機測定RNA 含量和OD260/OD280的比值。RT-PCR 法合成模板cDNA 后，以cDNA 為模板進行PCR擴增反應，具體反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性40 s，58 ℃退火50 s，60 ℃延伸2 min。共42 個循環(huán)。實驗過程中每個樣品至少設置3 個復孔，以β-actin基因為內參基因，用2-△△Ct來表示基因相對表達含量。

1.10 腦組織Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達測定

腦組織總蛋白的提取用4 ℃的RPMI 裂解液。BCA 法測定各樣品的蛋白含量，將所有的樣品用裂解液稀釋成4 mg/L，取10 μL 與4×上樣緩沖液混勻，調整蛋白進樣濃度為40 μg/10 μL。點樣后經過SDS-PAGE 電泳、轉膜，封閉液封閉等過程，加兔抗大鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3 和GAPDH 等一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3～4 次，二抗室溫孵育2 h 后TBST 洗膜3～4 次。電化學發(fā)光液化學發(fā)光顯影、定影后用Western-blot 分析儀進行圖片采集與拍照。蛋白條帶灰度值用Image J 圖像分析軟件進行處理與分析，目的蛋白相對表達水平=目的蛋白條帶的灰度值/內參蛋白條帶的灰度值。

1.11 數據的統(tǒng)計與處理

所有實驗數據經過SPSS 22.0 軟件分析，所得結果用“±s”表示，組別之間的差異分析方法采用One-Way-Anova，p＜0.05 為有顯著性差異，p＜0.01為有極顯著性差異。

2 結果

2.1 腦系數測定

單純輻射模型組大鼠體質量和腦系數均顯著降低（p＜0.01）；黃芪湯中、高劑量組大鼠腦系數顯著升高，并且其高劑量組體重也顯著升高（p＜0.05），見表1。

表1 各組動物體質量及腦系數檢測結果Table 1 The weight and the cerebral coefficient in each group (±s,n=10)

表1 各組動物體質量及腦系數檢測結果Table 1 The weight and the cerebral coefficient in each group (±s,n=10)

注：1p＜0.05，2 p＜0.01，與單純輻射模型組比較。Note: 1p＜0.05, 2 p＜0.01,compared with the radiation alone model group.

腦系數/(mg?g?1)Cerebral coefficient 7.50±0.772 4.84±0.48 6.82±0.381 6.61±0.331 5.98±0.43組別Group正常對照組Normal control group單純輻射模型組Radiation alone model group黃芪湯高劑量組Huangqi decoction high-dose group黃芪湯中劑量組Huangqi decoction middle-dose group黃芪湯低劑量組Huangqi decoction low-dose group體質量/g Body mass 235.09±19.912 174.37±17.02 224.34±21.731 198.44±15.18 187.36±20.99

2.2 觀察腦組織病理形態(tài)學改變

正常對照組大鼠腦組織神經細胞排列整齊、規(guī)則，形態(tài)結構正常；單純輻射模型組大鼠腦組織排列疏松，神經細胞數量減少，神經細胞核固縮、深染，血管周圍間隙增寬，神經細胞周圍間隙增寬；黃芪湯低、中劑量組腦組織排列疏松，神經細胞數量減少，血管周圍間隙增寬；黃芪湯高劑量組腦組織排列疏松及神經細胞數量減少等情況較單純輻射組明顯好轉，但未完全恢復正常，見圖1。

2.3 腦組織神經細胞凋亡率測定

單純輻射模型組和黃芪湯低劑量組大鼠腦組織的神經細胞發(fā)生明顯凋亡現(xiàn)象，黃芪湯中、高劑量組大鼠腦組織的神經細胞凋亡現(xiàn)象明顯減輕，但未恢復到正常組水平。單純輻射模型組大鼠腦組織的神經細胞存在大量凋亡細胞（p＜0.01）；黃芪湯中、高劑量組的腦組織細胞凋亡百分率顯著降低（p＜0.01）。見圖2和圖3。

2.4 腦組織Bcl-2、Bax和Caspase-3基因表達測定

單純輻射模型組大鼠腦組織Bcl-2 基因表達顯著降低，Bax 和Caspase-3 基因表達顯著升高（p＜0.01）；黃芪湯中、高劑量組大鼠腦組織Caspase-3基因表達顯著降低，黃芪湯高劑量組大鼠腦組織Bax 基因表達也顯著降低，Bcl-2 基因表達顯著升高（p＜0.01）。見表2。

表2 各組動物腦組織Bcl-2、Bax和Caspase-3基因表達的檢測結果Table 2 Gene expressions of Bcl-2,Bax,and Caspase-3 in brain tissues in each group (±s，n=10）

表2 各組動物腦組織Bcl-2、Bax和Caspase-3基因表達的檢測結果Table 2 Gene expressions of Bcl-2,Bax,and Caspase-3 in brain tissues in each group (±s，n=10）

注：2 p＜0.01，與單純輻射模型組比較。Note: 2 p＜0.01,compared with the radiation alone model group.

Caspase-3(2-ΔΔCt)0.27±0.092 1.03±0.05 0.44±0.052 0.46±0.112 1.12±0.17組別Group正常對照組Normal control group單純輻射模型組Radiation alone model group黃芪湯高劑量組Huangqi decoction high-dose group黃芪湯中劑量組Huangqi decoction middle-dose group黃芪湯低劑量組Huangqi decoction low-dose group Bcl-2(2-ΔΔCt)2.67±0.412 1.05±0.07 2.03±0.152 1.10±0.17 1.04±0.19 Bax(2-ΔΔCt)0.35±0.062 1.08±0.02 0.44±0.072 1.05±0.20 1.27±0.15

2.5 腦組織Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達測定

單純輻射模型組大鼠腦組織Bcl-2 蛋白量表達顯著降低，Bax 和Caspase-3 蛋白表達量顯著升高（p＜0.01）；黃芪湯中、高劑量組大鼠腦組織Caspase-3 蛋白表達量顯著降低，黃芪湯高劑量組大鼠腦組織Bax 蛋白表達量也顯著降低，Bcl-2 蛋白表達量顯著升高（p＜0.01）。見表3和圖4。

表3 各組動物腦組織Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白灰度值的檢測結果Table 3 Protein expressions of Bcl-2,Bax,and Caspase-3 in brain tissues in each group (±s，n=10)

表3 各組動物腦組織Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白灰度值的檢測結果Table 3 Protein expressions of Bcl-2,Bax,and Caspase-3 in brain tissues in each group (±s，n=10)

注：1p＜0.05，2 p＜0.01，與單純輻射模型組比較。Note: 1p＜0.05, 2 p＜0.01,compared with the radiation alone model group.

Caspase-3(OD)0.32±0.042 0.69±0.09 0.40±0.082 0.47±0.052 0.74±0.02組別Group正常對照組Normal control group單純輻射模型組Radiation alone model group黃芪湯高劑量組Huangqi decoction high-dose group黃芪湯中劑量組Huangqi decoction middle-dose group黃芪湯低劑量組Huangqi decoction low-dose group Bcl-2(OD)0.87±0.092 0.35±0.05 0.45±0.031 0.38±0.03 0.34±0.04 Bax(OD)0.13±0.012 0.56±0.04 0.21±0.022 0.54±0.08 0.63±0.10

3 討論

重離子輻射發(fā)病過程具有急、猛、快、多，廣等特點，繼而引起機體各臟腑功能紊亂、氣血陰陽失調等惡候，兼挾火熱痰瘀、遷延難愈，其引發(fā)的病理演變過程符合毒邪致病的特點，因此，中醫(yī)學將其歸屬于“毒邪”的范疇［7-9］。機體受輻照后不僅可耗損人體正氣，還使體內火熱毒邪亢盛，嚴重耗損津液。因此，中醫(yī)認為火、瘀、虛是輻射損傷的基本病機［10］。根據輻射損傷的基本病機，中醫(yī)藥防護輻射損傷以培元固本、益氣滋陰、活血散瘀為基本治則。黃芪湯方中，熟地、枸杞子，滋陰補腎；五味子，益氣生津，滋腎養(yǎng)陰；麥冬，潤肺養(yǎng)陰；黃芪，補中益氣；人參大補元氣，補脾益肺，生津養(yǎng)血。諸藥合奏發(fā)揮益氣滋陰，生津養(yǎng)血之功效，使得“正氣存內，邪不可干”，起到防護輻射損傷的作用。

研究表明，輻射損傷最早期的生物學效應是細胞凋亡［11］。Bax、Bcl-2 和Caspase-3 是調控細胞凋亡的重要蛋白。Bcl-2是屬于Bcl-2家族的抗凋亡蛋白，Bax 是屬于Bcl-2 家族的促凋亡蛋白，Caspase-3是Bcl-2家族通過線粒體途徑調控細胞凋亡的下游促凋亡蛋白［12-14］。在線粒體凋亡調控通路中，當Bax形成Bax-Bax同源二聚體時會促進細胞凋亡，當Bax 形成Bax-Bcl-2 異源二聚體時會抑制細胞凋亡［15］。重離子輻射會激活機體受損組織的Bax過度表達，過度表達的Bax可通過線粒體途徑激活下游的Caspase-3，激發(fā)Caspase 發(fā)生級聯(lián)反應，促進受損組織的細胞凋亡［16］。但是，重離子輻射同時又會抑制機體受損組織Bcl-2 的過度表達，使Bax 無法與Bcl-2 形成異源二聚體，從而無法抑制Bax 蛋白對線粒體下游Caspase-3 的激活，進一步促進了Caspase的級聯(lián)效應，促進受損傷組織的細胞凋亡［17-18］。

本研究結果顯示，4 Gy12C6+離子束照射大鼠腦組織后，單純輻射模型組大鼠體質量及腦系數在照射后第7 天均顯著降低，并且其腦組織的Bcl-2的基因表達和蛋白表達也在照射后第7 天顯著降低，而腦組織的神經細胞凋亡率明顯增加，Bax和Caspase-3 的基因表達和蛋白表達則在照射后第7天顯著升高。腦組織病理形態(tài)顯示，單純輻射模型組大鼠腦組織排列疏松，神經細胞數量減少，神經細胞核固縮、深染，血管周圍間隙增寬，神經細胞周圍間隙增寬。說明12C6+離子束輻照后，凋亡相關蛋白Bax 過度表達和Bcl-2 過度抑制會促進線粒體凋亡通路激活，激活Caspase 的級聯(lián)反應，從而促進腦組織的神經細胞發(fā)生凋亡，進一步加重腦組織的病理形態(tài)損傷（見圖5）。

而在12C6+離子束照射大鼠腦組織之前預先給予黃芪湯干預1周，結果發(fā)現(xiàn)，黃芪湯中、高劑量組的腦系數顯著升高，而腦組織神經細胞凋亡率明顯降低，Caspase-3 的基因表達和蛋白表達均顯著降低；黃芪湯高劑量組體質量及腦組織Bcl-2 的基因表達和蛋白表達均升高，而其Bax的基因表達和蛋白表達均顯著降低。腦組織病理結果顯示，黃芪湯高劑量組腦組織排列疏松及神經細胞數量減少等情況較單純輻射組明顯好轉，但未完全恢復正常。說明黃芪湯的干預機制可能是通過抑制Bax過度表達和促進Bcl-2 過度表達來抑制線粒體凋亡通路激活，抑制Caspase 的級聯(lián)反應，從而抑制受12C6+離子束照射腦組織的神經細胞發(fā)生凋亡，進而緩解腦組織的病理形態(tài)損傷，發(fā)揮抗輻射作用（見圖6）。

綜上所述，黃芪湯中的黃芪、熟地、麥冬、人參、枸杞子和五味子通過益氣、生津、養(yǎng)血和滋陰等發(fā)揮抗輻射作用，具體機制可能是通過抑制線粒體凋亡通路來實現(xiàn)的。