陳達(dá)，周明武，楊瑞甫，宋立，幸超峰，李士民

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450042；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第988醫(yī)院 全軍創(chuàng)傷骨科中心，河南 鄭州 450042）

目前，骨缺損的治療一直是骨科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，臨床對于骨缺損的治療方法主要為自體骨移植、組織工程骨移植、同種異體骨移植等[1]。同種異體骨來源廣，有骨誘導(dǎo)、骨傳導(dǎo)等優(yōu)點(diǎn)，臨床上應(yīng)用已經(jīng)比較普遍[2]。但在骨缺損的修復(fù)過程中同種異體骨要伴隨著血管化和骨重建等問題，針對這些問題，很多學(xué)者進(jìn)行了深入的研究。其中，周明武等[3]通過把同種異體骨異位于兔股直肌與股內(nèi)側(cè)肌間隙內(nèi)近隱動脈處，10周后同種異體骨轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨?。周立[4]采取外源VEGF復(fù)合BMP能加快同種異體脫鈣骨轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨?，加速血管爬行替代修?fù)進(jìn)程，減少預(yù)構(gòu)骨瓣時間。蔣大偉[5]采用體外沖擊波（ESW）加速兔跟腱重建后腱骨愈合速度。本實(shí)驗(yàn)中，我們設(shè)想通過體外沖擊波（ESW）加快同種異體骨轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨堑乃俣取?/p>

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及器材

選用健康成年中國白兔120只為研究對象 (雌雄不限，體質(zhì)量為2.5～3.0 kg，鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供)；兔多克隆抗體(美國 Santa Cruz公司)；體外沖擊波疼痛治療儀器（瑞士 STORZ MP100）；擺鋸（上海博進(jìn)醫(yī)療器械）；DAB試劑盒(北京中杉生物工程公司)；S-P9000免疫組化試劑盒 (北京中杉生物工程公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(鄭州博興生物科技有限公司)；石蠟切片機(jī)(德國Lecia，RM，2235)；醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(上海山富科學(xué)儀器有限公司，Biosens Digital Imaging System v1.6)；鈷-60輻射源(河南省同位素研究所)；分析天枰(型號AEL-160-21)；溫箱(上海秣馬恒溫設(shè)備廠，型號DHG-9031)；冰箱(海爾)；照相顯微鏡(Olympus，型號BX63)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)動物分組：從120只健康白兔中隨機(jī)選取20只作為供體制備同種異體骨。其余100只按隨機(jī)數(shù)字表法分為觀察組50只，給予沖擊波（ESW）治療；對照組50只，未給予沖擊波（ESW）治療。

同種異體骨制備：隨機(jī)挑選20只白兔經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞處死，在無菌操作下取出雙脛骨，去除骨膜及周圍軟組織，擺鋸鋸成1.5 cm長的骨段并徹底去除骨段中的骨髓，用生理鹽水沖洗干凈后裝入無菌袋中密封保存，經(jīng)鈷-60照射滅菌1 d后放入-70℃深低溫冰箱去抗原3周，用生理鹽水沖洗干凈后留置備用。

手術(shù)方法：兩組均用濃度為10%水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量2.0～3.0 mL/kg，追加劑量0.5 mL/kg。麻醉成功后，右大腿內(nèi)側(cè)脫毛備皮后，取仰臥位固定于兔板，手術(shù)區(qū)消毒、鋪無菌單。沿白兔大腿內(nèi)側(cè)伴隱動脈走行做一約4.0 cm長的手術(shù)切口，鈍性分離軟組織并注意保護(hù)隱動脈。將同種異體骨段放置在股直肌與股內(nèi)側(cè)肌間并用兩根0.8 mm的克氏針固定在股骨上，隨后逐層縫合肌肉、肌膜、皮膚。

術(shù)后處理：所有動物均單籠喂養(yǎng)，慶大霉素肌注8萬U/次，2次/d，連續(xù)注射3 d預(yù)防切口感染。術(shù)后第2周手術(shù)切口愈合良好給予拆線處理。觀察組造模動物第2周起于右側(cè)后腿術(shù)區(qū)周圍行體外沖擊波干預(yù)。操作時耦合劑盡量避開切口，設(shè)置頻率4 Hz，壓力1 bar，能量輸出為0.16 mJ/mm2，予以單次沖擊1 500次，1次/周，共10次，整個干預(yù)過程中不予麻醉。在喂養(yǎng)過程中，未發(fā)生感染、死亡現(xiàn)象。

1.3 觀察指標(biāo)

大體標(biāo)本觀察：兩組白兔分別于術(shù)后第2、4、8、10、12周各取10只白兔耳緣靜脈空氣栓塞后，沿原手術(shù)切口進(jìn)入。觀察異位同種異體骨段生長情況。然后剝離骨段周圍軟組織，進(jìn)一步觀察骨段表面變化。

免疫組織化學(xué)染色及免疫熒光檢測：取出標(biāo)本后即用10%甲醛溶液固定24 h。脫水、脫鈣、石蠟包埋、切片、HE染色，每組任取10切片。常規(guī)脫蠟脫水，通過免疫熒光染色法對特異性標(biāo)記物Ⅰ型膠原蛋白進(jìn)行原位熒光標(biāo)記。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。分析數(shù)據(jù)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示；對同一組內(nèi)各觀察指標(biāo)在不同時間點(diǎn)和兩組間觀察指標(biāo)在同一時間點(diǎn)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。若P＜0.05認(rèn)為兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

術(shù)后14 d兩組動物切口均愈合良好，無紅腫，無炎性滲出，給予拆線處理。術(shù)后第2周，沿原切口逐層切開皮膚、肌肉后觀察到兩組同種異體骨骨段表面較光滑，無明顯變化。術(shù)后第4周觀察組同種異體骨骨段表面開始覆蓋少許結(jié)締組織，與第2周骨段相比出現(xiàn)少量骨吸收陷窩；對照組觀察到同種異體骨骨段與周圍組織粘連疏松，同種異體骨骨段表面仍較光滑，吸收陷窩不明顯。術(shù)后第8周，兩組同種異體骨骨段與周圍組織貼附緊密，同種異體骨骨段表面有較多結(jié)締組織覆蓋并且觀察組骨段表面陷窩較對照組多且深。術(shù)后第10周，兩組同種異體骨骨段與周圍組織貼附緊密，同種異體骨骨段表面陷窩進(jìn)一步加深。術(shù)后第12周，兩組同種異體骨骨段均被結(jié)締組織嚴(yán)密包裹，不易分離，同種異體骨表面陷窩深度及個數(shù)差別較小，但相比第10周時同種異體骨骨段表面陷窩加深。

2.2 組織學(xué)觀察

從圖1中看出，第2周時，觀察組和對照組哈弗管周圍出現(xiàn)少許肉芽組織；第4周時，觀察組哈弗管內(nèi)出現(xiàn)較多新生微血管和一些新生的骨質(zhì)，對照組哈弗管內(nèi)新生微血管增多，有少許類骨質(zhì)不規(guī)律的分布在管腔旁，較觀察組少；第8周時，觀察組哈弗管腔周圍可見較多骨細(xì)胞，新生骨組織成熟、致密，對照組有部分成骨細(xì)胞分布在哈弗管周圍，新骨生成較觀察組少且不規(guī)律；第10周時，觀察組和對照組管腔周圍骨細(xì)胞均較前期增加，新生骨組織均成熟致密；第10至第12周，觀察組新生骨組織規(guī)律地分布在管腔周圍，變化與第10周不明顯；對照組與觀察組第10周相似。

2.3 免疫熒光檢測結(jié)果

從圖2和表1可以看出兩組Ⅰ型膠原蛋白整體變化趨勢：觀察組在第8周前Ⅰ型膠原蛋白吸光度值一直在緩慢上升，第8周至第12周Ⅰ型膠原蛋白吸光度值呈下降趨勢；前8周每次觀察點(diǎn)Ⅰ型膠原蛋白吸光度值與上一觀察點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，第8周與第10周和第12周比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。對照組從第2周至第10周Ⅰ型膠原蛋白吸光度值一直處于上升狀態(tài)，每次觀察點(diǎn)Ⅰ型膠原蛋白吸光度值與上一觀察點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，第10周至第12周出現(xiàn)下降趨勢，第10周與第12周比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)

圖 1 術(shù)后不同時間點(diǎn)標(biāo)本異體骨的組織學(xué)觀察（HE×200），A1-A5 為對照組第 2、4、8、10、12 周；B1-B5 為觀察組第 2、4、8、10、12 周

圖 2 術(shù)后同種異體骨標(biāo)本Ⅰ型膠原蛋白（免疫熒光染色×200），A1-A5 為對照組第 2、4、8、10、12 周；B1-B5為觀察組第 2、4、8、10、12 周

表1 觀察組與對照組I型膠原蛋白吸光度值比較(±s)

表1 觀察組與對照組I型膠原蛋白吸光度值比較(±s)

注：a：組內(nèi)第4周與第2周比較，P＜0.05；b：組內(nèi)第8周與第4周比較，P＜0.05；c：組內(nèi)第10周與第8周比較P＜0.05；d：同一時間點(diǎn)組間比較，P＜0.05

組別 n 第2周 第4周 第8周 第10周 第12周對照組 50 12.16±1.06 18.92± 4.33a 34.73±8.41b 45.07±6.02c 43.76± 7.81觀察組 50 12.31±1.10 24.02±10.28ad 47.57±3.50bd 45.89±5.10d 44.04±12.27

3 討論

由感染、腫瘤、創(chuàng)傷、骨髓炎手術(shù)清創(chuàng)等導(dǎo)致的骨缺損，一直是骨科研究的熱點(diǎn)[6-7]。同種異體骨移植具有來源豐富、使用方便、骨細(xì)胞已被滅活、免疫原性低、具有結(jié)構(gòu)支持等諸多優(yōu)點(diǎn)。但同種異體骨在修復(fù)骨缺損時，需經(jīng)過血管再生及骨再生[8]。李揚(yáng)等[9]證實(shí)兔大段感染脛骨經(jīng)煮沸滅菌后異位于肌肉豐富的知名血管處，使其再血管化，轉(zhuǎn)化為血管化骨是可行的。但人的皮質(zhì)骨更厚、骨密度更高，同種異體骨變成活化骨所需的時間更長。因此，加快同種異體骨活化進(jìn)程，縮短預(yù)構(gòu)骨皮瓣形成時間尤為重要。

隨著對體外沖擊波（ESW）研究的不斷深入，梁斌等[10]認(rèn)為體外沖擊波治療骨不連是一種創(chuàng)傷小、效果確切的較理想的治療方法。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)沖擊波可以促進(jìn)各種促血管生成和促骨生長因子的表達(dá)，促進(jìn)了骨折的愈合，為沖擊波治療骨缺損、骨不連、骨壞死提供了有力證據(jù)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇體外沖擊波（ESW）促進(jìn)同種異體骨骨活化進(jìn)程。

對于同種異體骨，采用鈷-60輻射，凍干處理降低免疫原性，明顯降低排斥反應(yīng)[12]。Wei等[13]使用了兩種凍干同種異體骨治療大鼠股骨骨缺損，通過micro-CT掃描和組織學(xué)分析，凍干同種異體骨均持續(xù)形成新骨，具備良好的骨誘導(dǎo)和成骨能力。因此異體骨采用凍干處理、鈷-60輻射后可被廣泛應(yīng)用于各種病因?qū)е碌墓侨睋p，為預(yù)構(gòu)骨皮瓣創(chuàng)造條件。

Ⅰ型膠原蛋白作為骨基質(zhì)中主要的有機(jī)成分，可間接地反應(yīng)出異位的同種異體骨的成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的數(shù)量及同種異體脫鈣骨的骨活性程度[14]。在同種異體骨骨活化過程中成骨細(xì)胞的增殖和分化非?；钴S，合成和分泌Ⅰ型膠原蛋的能力也隨之增強(qiáng)，有效地促進(jìn)新骨形成。

本實(shí)驗(yàn)中我們將同種異體骨埋于兔右側(cè)大腿的股直肌與股內(nèi)側(cè)肌之間，術(shù)后給予體外沖擊波（ESW）輔助治療。第2、4、8、10、12周通過測量同種異體骨內(nèi)的Ⅰ型膠原蛋白免疫熒光強(qiáng)度值顯示：觀察組和對照組分別在第8周和第10周Ⅰ型膠原蛋白免疫熒光強(qiáng)度達(dá)到峰值。觀察組的骨活化速度快于對照組，達(dá)到峰值時，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。主要因?yàn)轶w外沖擊波（ESW）不僅具有誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的生成，并且具有促進(jìn)骨組織的新陳代謝作用。當(dāng)體外沖擊波遇到骨組織時，形成的壓力波作用于細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜的離子通道微觀極性變化，加速細(xì)胞內(nèi)外離子交換過程，骨組織的新陳代謝加快[15]，減少骨活化時間；骨折端會形成類似新鮮骨折血管反應(yīng)，成骨細(xì)胞被激活，局部微血管會逐步增多；促進(jìn)周圍組織釋放大量具有多種活性的生物調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞因子，直接誘導(dǎo)多種細(xì)胞分化并形成成骨細(xì)胞[16]。

綜上所述，體外沖擊波（ESW）可明顯加快異位兔同種異體骨骨活化進(jìn)程，縮短其完成骨活化時間，為臨床加速預(yù)構(gòu)同種異體骨骨皮瓣修復(fù)骨缺損提供理論依據(jù)。