陳有科 高良輝 符 譽 黃小龍

海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科 (海南 ?？? 570102)

化療是肝癌臨床治療的一個重要手段，但是化療期間原發(fā)性或繼發(fā)性腫瘤多藥耐藥(MDR)的產(chǎn)生常使化療效果并不理想[1]。MDR的機制復(fù)雜多樣，自噬是細(xì)胞對抗環(huán)境應(yīng)激的一種保護性反應(yīng)，近年來的研究發(fā)現(xiàn)自噬參與了腫瘤MDR的過程[2]。微小RNA(miRNA) 是體內(nèi)一小段非編碼核酸序列，其可以調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移或耐藥過程[3]，微小RNA-200c(miR-200c) 屬于miR-200家族成員，研究發(fā)現(xiàn)miR-200c水平是肝細(xì)胞癌的獨立危險因素，參與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)，與患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)[4]。本研究以肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞株，以及其多藥耐藥HepG2/ADM細(xì)胞株為對象，探討miR-200c對在自噬的調(diào)控以及對肝癌MDR的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人肝癌HepG2和HepG2/ADM細(xì)胞株購自廣州吉賽生物科技有限公司，多柔比星購于美國Sigma公司，RIPA蛋白裂解液、細(xì)胞MTT測試試劑盒購自美國Promega公司，miR-200c(forward,5′-AGGGGTGAGACTAGGCAGGTTGG-3；reverse,5′-CCAGGTTGCAGTCCAAGCA-3′)和內(nèi)參U6(forward,5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′;reverse,5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′)引物由上海生工科技有限公司設(shè)計合成，RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green qPCR superMix熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司產(chǎn)品。脂質(zhì)體2000和Trizol購自美國Invitrogen公司，含有miR-200c類似物序列(miR-200c mimics)和陰性對照無關(guān)序列(negative control miRNA)的pEZ-M02-UBQLN1質(zhì)粒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。Beclin-1、LC3Ⅱ和β-actin抗體購于美國Cell signal公司。酶聯(lián)免疫檢測儀購自美國Bio-Rad公司，實時PCR儀購自美國ABI公司，透射電鏡購自東京杰爾有限公司，超薄切片機購自日本JEOL公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 實驗分組和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 肝癌和肝癌耐藥細(xì)胞分為4組：HepG2組、HepG2/ADM組、陰性轉(zhuǎn)染對照組和miR-200c類似物轉(zhuǎn)染組。HepG2組和HepG2/ADM組不進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，陰性轉(zhuǎn)染對照組HepG2/ADM細(xì)胞轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒miRNA- pEZ-M02-UBQLN1質(zhì)粒，miR-200c類似物轉(zhuǎn)染組HepG2/ADM細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-200c mimics- pEZ-M02-UBQLN1質(zhì)粒，按照脂質(zhì)體2 000試劑盒說明書操作，陰性轉(zhuǎn)染對照組和miR-200c類似物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞換無血清的培養(yǎng)液，脂質(zhì)體2 000處理細(xì)胞后加入相應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染2 h，去除培養(yǎng)液，換用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，實時PCR方法檢測轉(zhuǎn)染效果，采用2-△△CT法計算miR-200c基因的相對表達(dá)量。

1.3 MTT方法測定細(xì)胞對化療藥物的敏感性 4組細(xì)胞分別消化為單細(xì)胞懸液，按2 000個/孔接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的多柔比星(100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78 125 μmol/L)，培養(yǎng)48 h后每孔加入含10 μl MTT的培養(yǎng)基200 μl，培養(yǎng)箱中孵育4 h后去上清，加入100 μl DMSO溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光度，計算多柔比星作用于各組細(xì)胞的IC50值。

1.4 透射電子顯微鏡(TEM)分析細(xì)胞自噬體 收集4組細(xì)胞，3 000 g離心10 min后用1% OsO4、0.1 mol/L碳酸鈣緩沖液固定細(xì)胞4 h，梯度乙醇脫水后嵌入環(huán)氧丙烷，超薄切片機制作80 nm切片，1%醋酸鈾酯和0.2%檸檬酸鉛染色，TEM下觀察自噬體，計算每個高倍視野下(8 000×)自噬體數(shù)。

1.5 自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ的表達(dá) 收集4組細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，Western Blot方法檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ的表達(dá)，ImageJ軟件對照內(nèi)參分析目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS16.0軟件進行分析，多組均數(shù)間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞miR-200c表達(dá)的差異及對化療藥物的敏感性(IC50)情況 見表1。

表1 各組細(xì)胞miR-200c表達(dá)及IC50值情況

2.2 miR-200c影響各組細(xì)胞自噬情況 HepG2組、HepG2/ADM組、陰性轉(zhuǎn)染對照組和miR-200c類似物轉(zhuǎn)染組高倍視野下自噬體分別為(0.16±0.04)個、(4.82±1.03)個、(4.77±1.01)個和(1.35±0.33)個，其中HepG2/ADM組自噬體顯著多于HepG2組(P<0.01)，HepG2/ADM組和陰性轉(zhuǎn)染對照差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，miR-200c類似物轉(zhuǎn)染組自噬體顯著少于HepG2/ADM組(P<0.01)，見圖1。

圖1 各組細(xì)胞的自噬體 (TEM，8 000×)

箭頭標(biāo)示處為自噬體，A.HepG2組，B.HepG2/ADM組，C.陰性轉(zhuǎn)染對照組，D.miR-200c類似物轉(zhuǎn)染組

2.3 miR-200c對HepG2/ADM細(xì)胞自噬蛋白的影響 HepG2組、HepG2/ADM組、陰性轉(zhuǎn)染對照組和miR-200c類似物轉(zhuǎn)染組Beclin-1蛋白的相對表達(dá)量分別為(0.18±0.02)、(0.57±0.11)、(0.55±0.09)和(0.27±0.05)，LC3-Ⅱ蛋白的相對表達(dá)量分別為(0.11±0.02)、(0.63±0.14)、(0.60±0.13)和(0.21±0.04)，其中HepG2/ADM組Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白相對表達(dá)量顯著高于HepG2組(P<0.01)，HepG2/ADM組和陰性轉(zhuǎn)染對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，miR-200c類似物轉(zhuǎn)染組Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白相對表達(dá)量顯著低于HepG2/ADM組(P<0.01)，見圖2。

圖2 Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的情況A.HepG2組，B.HepG2/ADM組，C.陰性轉(zhuǎn)染對照組，D.miR-200c類似物轉(zhuǎn)染組

3 討論

腫瘤的MDR機制極其復(fù)雜，有多種因素的參與，其中miRNA對靶基因的調(diào)節(jié)是一個重要的原因[5]，miR-200c廣泛存在于生物體，研究顯示其在肝癌中可以發(fā)揮抑癌作用[6]，Koo等[7]研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-200c可以增加腫瘤細(xì)胞對化療的敏感性。本研究使用HepG2和HepG2/ADM細(xì)胞，結(jié)果顯示多柔比星對HepG2/ADM細(xì)胞IC50值顯著高于HepG2細(xì)胞，檢驗了HepG2/ADM細(xì)胞的耐藥性，可以用于后續(xù)的研究，PCR分析顯示HepG2/ADM細(xì)胞miR-200c的相對表達(dá)量顯著低于HepG2細(xì)胞，說明了miR-200c低表達(dá)可能參與了肝癌的MDR。丁紅等[8]的研究發(fā)現(xiàn)上調(diào) miR-200c 表達(dá)可以靶向人肝癌干細(xì)胞，拮抗化療耐藥性，提示了靶向miR-200c可以調(diào)節(jié)肝癌的MDR。本研究進一步在HepG2/ADM細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-200c類似物過表達(dá)miR-200c，結(jié)果顯示多柔比星對miR-200c類似物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的IC50值顯著低于HepG2/ADM組，也說明了上調(diào)miR-200c可以克服肝癌的MDR。

自噬是一種重要的細(xì)胞生存機制，在正常生理過程中起著“管家”的作用，清除受損的細(xì)胞器、抵御病原體、調(diào)節(jié)生長和衰老，自噬調(diào)節(jié)缺陷在許多疾病中起著重要作用，調(diào)節(jié)自噬也有助于癌癥的治療[9]。自噬也參與到腫瘤MDR的調(diào)節(jié)中，王浩等[10]抑制大腸癌細(xì)胞的自噬活性，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率增加，可以恢復(fù)部分藥物敏感性，提示了調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬可以作為一個抗腫瘤MDR的途徑。Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白是自噬激活的標(biāo)志蛋白[11]，本研究發(fā)現(xiàn)HepG2/ADM組自噬體、Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白顯著多于HepG2組，提示了肝癌耐藥中存在自噬的過度激活。Sun等[12]發(fā)現(xiàn)miR-200c可以抑制乳腺癌細(xì)胞的自噬激活，從而顯著增加細(xì)胞的放療敏感性。本研究發(fā)現(xiàn)miR-200c類似物轉(zhuǎn)染組自噬體、Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白顯著低于HepG2/ADM組，說明了miR-200c可以抑制HepG2/ADM細(xì)胞的自噬激活，MTT細(xì)胞增殖分析也顯示了miR-200c類似物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞對多柔比星的敏感性得到了顯著改善。

綜上所述，本研究顯示上調(diào)miR-200c表達(dá)可以抑制HepG2/ADM細(xì)胞自噬，增加HepG2/ADM細(xì)胞對化療藥物的敏感性。