石林昌 王雅冰 趙孟杰 孫景武

河北中石油中心醫(yī)院肝膽外科 (河北 廊坊， 065000)

肝癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，惡性程度高，預(yù)后差，死亡率目前位居所有惡性腫瘤第3位。乙型肝炎病毒感染是國(guó)內(nèi)造成肝癌發(fā)病率升高的主要原因，肝癌的早期診斷及治療對(duì)于改善患者預(yù)后具有重要意義[1]。傳統(tǒng)的診斷方法是采取甲胎蛋白(AFP)進(jìn)行預(yù)測(cè)，但是診斷準(zhǔn)確性與可靠性值得商榷。近年來(lái)分子生物學(xué)指標(biāo)的發(fā)展使得越來(lái)越多的指標(biāo)在臨床應(yīng)用，Rho GTP酶屬于同細(xì)胞骨架、細(xì)胞黏附關(guān)系密切物質(zhì)，表達(dá)升高會(huì)造成腫瘤發(fā)生侵犯與轉(zhuǎn)移，鳥嘌呤核苷酸抑制因子2(RhoGDI2)則是調(diào)節(jié)Rho GTP 酶活性的重要因子；N-myc下游并受其調(diào)節(jié)基因2(NDRG2)則是臨床新近發(fā)現(xiàn)的基因家族，同細(xì)胞增殖與分化關(guān)系密切，可以參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，與細(xì)胞生長(zhǎng)與分化關(guān)系密切[2]。本研究分析了RhoGDI2和NDRG2在肝癌組織中的表達(dá)，以期為臨床提供指導(dǎo)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年6月至2019年8月在我院治療的肝癌患者89例，其中男51例，女38例；年齡30～61歲，中位年齡50.40歲。術(shù)中采集肝癌組織及癌旁組織，即距離腫瘤邊緣超過(guò)5 cm作為對(duì)照。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理檢查確診；②術(shù)前未行放化療等抗腫瘤治療；③隨訪資料保存完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有其他惡性腫瘤者；②繼發(fā)轉(zhuǎn)移性肝癌者。

1.2 免疫組化染色 組織固定、石蠟包埋，切成厚度4 μm切片，免疫染色按照試劑盒流程操作，按照脫蠟、脫水、抗原修復(fù)、封閉、加抗體、染色步驟在鏡下觀察，陰性對(duì)照采用PBS代替一抗，觀察RhoGDI2、NDRG2蛋白表達(dá)情況。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。①染色強(qiáng)度：無(wú)著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分，棕褐色為4分；②陽(yáng)性細(xì)胞比例低于25%為1分，26%～50%為2分，51%～70%為3分，超過(guò)70%為4分。①+②最終得分≥3分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0軟件，陽(yáng)性表達(dá)率比較使用χ2檢驗(yàn)，RhoGDI2和NDRG2表達(dá)相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 肝癌和癌旁組織RhoGDI2、NDRG2表達(dá) 肝癌組織RhoGDI2陽(yáng)性表達(dá)率為69.66%，明顯高于癌旁組織的28.09%(P<0.05)，而NDRG2陽(yáng)性表達(dá)率為22.47%，明顯低于癌旁組織的97.75%(P<0.05)。見插頁(yè)彩圖1。

2.2 RhoGDI2、NDRG2表達(dá)與臨床病理關(guān)系 Ⅲ～Ⅳ期患者RhoGDI2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)，而NDRG2陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者RhoGDI2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征患者的RhoGDI2、NDRG2陽(yáng)性表達(dá)率 [例(%)]

2.3 相關(guān)性分析 肝癌組織RhoGDI2與NDRG2表達(dá)的相關(guān)分析結(jié)果顯示，RhoGDI2與NDRG2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.406，P<0.05)。

2.4 RhoGDI2、NDRG2表達(dá)與患者復(fù)發(fā)、預(yù)后的關(guān)系 截止隨訪結(jié)束日2019年10月，共有36例患者復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為40.45%；復(fù)發(fā)患者RhoGDI2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于無(wú)復(fù)發(fā)患者(P<0.05)，而NDRG2陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于無(wú)復(fù)發(fā)患者(P<0.05)。29例患者死亡，60例患者存活；死亡患者RhoGDI2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于存活患者(P<0.05)，而NDRG2陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于存活患者(P<0.05)。見表2。

表2 RhoGDI2、NDRG2表達(dá)與患者復(fù)發(fā)、預(yù)后的關(guān)系 [例(%)]

3 討論

原發(fā)性肝癌屬于臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，是目前世界范圍內(nèi)死亡率最高的癌癥之一，目前在我國(guó)肝癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)，預(yù)后極差，有報(bào)道顯示診斷后5年生存率不足5%[3]。目前認(rèn)為肝癌的發(fā)生和發(fā)展是多因素、多階段的過(guò)程，一般認(rèn)為肝細(xì)胞惡性腫瘤主要由乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒慢性感染或者黃曲霉毒素感染造成肝硬化進(jìn)而演變而來(lái)。由于肝癌發(fā)病隱匿，臨床癥狀不典型，因此多數(shù)患者就診時(shí)已處于中晚期，外科手術(shù)一直是治療肝癌的首選方法，但是外科手術(shù)治療也無(wú)法達(dá)到完全根除腫瘤的目的，術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移會(huì)影響患者預(yù)后[4]。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞是慢周期細(xì)胞，大部分處于細(xì)胞分裂周期的G0和G1周期，一旦受到外界刺激情況下將表達(dá)具有化學(xué)抵抗分子或者活化的信號(hào)通路，導(dǎo)致進(jìn)行細(xì)胞分裂增殖周期，但是在手術(shù)后未被殺死腫瘤干細(xì)胞會(huì)進(jìn)入到細(xì)胞周期并參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和分化過(guò)程，也是術(shù)后導(dǎo)致肝癌復(fù)發(fā)的重要原因[5]。病理學(xué)檢查一直是肝癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是在部分患者中可能出現(xiàn)假陰性率，而且在操作的過(guò)程中也可能導(dǎo)致腫瘤破裂引發(fā)播散種植的風(fēng)險(xiǎn)[6]。近年來(lái)化學(xué)腫瘤標(biāo)記物檢查在臨床應(yīng)用越來(lái)越廣泛，其中AFP是原發(fā)性肝癌應(yīng)用最廣泛的標(biāo)記物，但是近年來(lái)研究顯示其缺乏敏感性與特異性，尤其是在肝炎、肝硬化患者病變急劇惡化時(shí)AFP數(shù)值也會(huì)顯著升高，而且在妊娠或者炎癥反應(yīng)過(guò)程中AFP也存在假陽(yáng)性的結(jié)果，而在部分原發(fā)性肝癌患者中也存在AFP陰性或者數(shù)值較低的情況，但是目前臨床尚無(wú)更為可靠地血清標(biāo)記物取代AFP在肝癌診斷中的低位[7，8]。

研究顯示肝癌的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)分子通路，牽涉的基因較多，而且越來(lái)越多的研究希望相關(guān)基因可以作為靶點(diǎn)，對(duì)肝癌進(jìn)行早期診斷并開展治療[9]。NDRG2在正常組織中廣泛表達(dá)，但是在腫瘤組織中幾乎不表達(dá)，而且表達(dá)的量與器官成熟程度具有正相關(guān)關(guān)系，成熟度越高且增殖能力越低的細(xì)胞中表達(dá)更多。一方面該基因可以參與細(xì)胞的分化過(guò)程，有報(bào)道指出NDRG2能夠減弱轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌細(xì)胞浸潤(rùn)過(guò)程，同時(shí)可以抑制裸鼠轉(zhuǎn)移酶的活性，提示其在誘導(dǎo)分化與逆轉(zhuǎn)表型抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移具有重要意義[10]。另一方面該基因可以參與應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)模擬缺氧條件造成細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，可以誘發(fā)形成活性氧通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)相關(guān)基因表達(dá)，而且腫瘤發(fā)生后會(huì)啟動(dòng)NDRG2啟動(dòng)子活性并在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的過(guò)程中會(huì)抑制NDRG2表達(dá)[11]。RhoGDI2屬于Rho GTPases 蛋白家族重要的調(diào)節(jié)因子，可以對(duì)該蛋白家族分布與活性狀態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)，對(duì)細(xì)胞的分裂、形態(tài)改變、血管侵犯等多種生物學(xué)行為進(jìn)行影響[12]。研究發(fā)現(xiàn)RhoGDI2在多種腫瘤組織中形成異常表達(dá)過(guò)程，該因子可以和各種受體、解離因子之間相互作用，通過(guò)促進(jìn)Rho GTPases 釋放的蛋白質(zhì)并運(yùn)送至細(xì)胞膜并產(chǎn)生激活作用發(fā)揮解離因子效果[13]；同時(shí)RhoGDI2在內(nèi)皮細(xì)胞中可以在酶作用下發(fā)生磷酸化過(guò)程，研究發(fā)現(xiàn)其表達(dá)會(huì)造成腫瘤細(xì)胞對(duì)失巢凋亡敏感程度，腫瘤細(xì)胞由于喪失和其他細(xì)胞黏附造成凋亡信號(hào)通路表達(dá)不通，因此腫瘤細(xì)胞極易發(fā)生轉(zhuǎn)移[14，15]。

本研究顯示，肝癌組織RhoGDI2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，而NDRG2陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁組織，說(shuō)明在肝癌組織中存在RhoGDI2表達(dá)升高，NDRG2表達(dá)降低。Ⅲ～Ⅳ期患者RhoGDI2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者，而NDRG2陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于Ⅰ～Ⅱ期患者；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者RhoGDI2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，說(shuō)明隨著肝癌患者分期越晚且出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者RhoGDI2陽(yáng)性表達(dá)率更高，而分期越早的肝癌患者NDRG2陽(yáng)性表達(dá)率越低。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，RhoGDI2與NDRG2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明兩者同肝癌發(fā)生具有一定的關(guān)聯(lián)。本組研究還發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)患者RhoGDI2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于無(wú)復(fù)發(fā)患者，而NDRG2陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于無(wú)復(fù)發(fā)患者，同時(shí)死亡患者RhoGDI2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于存活患者，而NDRG2陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于存活患者，說(shuō)明肝癌患者復(fù)發(fā)、存活與RhoGDI2、NDRG2表達(dá)具有一定的聯(lián)系。本研究?jī)?yōu)勢(shì)在于證實(shí)了RhoGDI2與NDRG2表達(dá)同肝癌患者發(fā)生和發(fā)展具有一定的關(guān)系，對(duì)患者預(yù)后具有一定的判斷意義，但是本研究隨訪時(shí)間短，入組病例有限，因此還需擴(kuò)充樣本量、長(zhǎng)期隨訪深入研究論證。