夏勝 蔡紅菊 施蘭

摘 要：為建立香龍血樹(shù)嵌合體組織培養(yǎng)快速繁殖體系，以金邊香龍血樹(shù)和金心香龍血樹(shù)的葉片、莖段為外植體，研究愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)及繼代增殖培養(yǎng)情況。結(jié)果表明：2種材料葉片均未誘導(dǎo)出愈傷組織;金邊香龍血樹(shù)莖段愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為：MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5mg/L 2，4-D+0.5g/L活性炭;金心香龍血樹(shù)莖段愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基均為：MS+5.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5g/L活性炭;金邊及金心香龍血樹(shù)正常愈傷組織誘導(dǎo)不定芽分化最佳培養(yǎng)基為：MS+3.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5g/L活性炭;金邊香龍血樹(shù)嵌合體愈傷組織誘導(dǎo)不定芽分化最佳培養(yǎng)基為：MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5g/L活性炭;金邊香龍血樹(shù)綠色不定芽增殖最佳培養(yǎng)基為：MS+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.5g/L活性炭;金邊香龍血樹(shù)嵌合體不定芽和金心香龍血樹(shù)綠色不定芽增殖最佳培養(yǎng)基為：MS+3.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5g/L活性炭。

關(guān)鍵詞：香龍血樹(shù);嵌合體;離體培養(yǎng)

中圖分類(lèi)號(hào) S687文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2020）22-0029-05

Abstract：Using the leaves and stems of as the explants，callus induction culture and the subculture proliferation culture were studied on Dracaena fragrans cv. lindenii and Dracaena fragrans cv. massangeana with a view to establishing a tissue culture rapid propagation system of Dracaena fragrans chimera. The results showed that the leaves of both materials were not able to induce callus. MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5mg/ L2，4-D+0.5g/L activated carbon was the best medium for inducing the callus of the stem section of Dracaena fragrans cv. Lindenii，MS+5.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5g/L activated carbon was the best medium for callus induction of the stem section of Dracaena fragrans cv. Massangeana，MS+3.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5g/L activated carbon was the best medium for inducing adventitious bud differentiation of normal callus of Dracaena fragrans cv. lindenii and Dracaena fragrans cv. Massangeana，MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5g/L activated carbon was the optimal medium for chimera callus of Dracaena fragrans cv. lindenii inducing differentiation of adventitious buds，MS+3.0mg/ L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.5g/L activated carbon was the optimal medium for adventitious bud proliferation of Dracaena fragrans cv. Lindenii，MS+3.0mg/L 6-BA+0.5mg /LNAA+0.5g/L activated carbon was the best medium for the proliferation of adventitious buds of Dracaena fragrans cv. lindenii chimera and green adventitious buds of Dracaena fragrans cv. massangeana.

Key words：Dracaena fragrans;Chimera;In vitro culture

香龍血樹(shù)（Dracaena fragrans）是百合科龍血樹(shù)屬常綠喬木植物，別名也門(mén)鐵、大龍血樹(shù)、香千年木、巴西木、巴西鐵樹(shù)、山德氏龍血樹(shù)[1]，呈灌木或喬木狀，莖較粗，葉片寬大，叢生于莖頂，穗狀花序，花小，帶有濃烈的香氣，是良好的香味樹(shù)種，極具觀賞價(jià)值[2]。

香龍血樹(shù)被廣泛用作園林園藝中流行的觀葉植物，其主要繁殖方法包括扦插繁殖、高空壓條繁殖、種子繁殖，最快的繁殖方法是組織培養(yǎng)，利用該技術(shù)可以生產(chǎn)無(wú)毒的幼苗，獲得大規(guī)模育苗，有效地解決市場(chǎng)種苗短缺的問(wèn)題。Vinterhalte最早采用組織培養(yǎng)技術(shù)成功誘導(dǎo)出香龍血樹(shù)的愈傷組織并培育成苗[2]。漆麗萍等[3]、何業(yè)華等[4]、陳興華等[5]、陳麗文等[6]采用MS作為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加IAA、6-BA、KT、Ad、NAA、IBA等作為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，以香龍血樹(shù)的莖段、腋芽、頂芽、葉片為接種材料，通過(guò)研究都已經(jīng)取得了成功。

嵌合體植株極具觀賞價(jià)值，嵌合體會(huì)使植株葉片出現(xiàn)2種或2種以上的不同顏色，主要是通過(guò)不同遺傳類(lèi)型的植物組織細(xì)胞保留在頂端細(xì)胞系統(tǒng)中轉(zhuǎn)化成為分生組織后分化出葉原基而形成，能夠培育出多種稀奇的新品種植物[7]。嵌合體植物因其色彩絢麗、奇異新穎，已被很多國(guó)家廣泛研究和利用，在觀賞植物市場(chǎng)的開(kāi)發(fā)和利用中發(fā)揮著重要作用。我國(guó)植物資源豐富，種類(lèi)繁多，觀賞植物的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)具有十分廣闊的前景，加強(qiáng)植物嵌合體的研究，促進(jìn)其開(kāi)發(fā)利用，具有十分重大的意義和價(jià)值[8]。常見(jiàn)的香龍血樹(shù)嵌合體栽培品種有金邊香龍血樹(shù)、金心香龍血樹(shù)、黃邊香龍血樹(shù)、銀邊香龍血樹(shù)[9]。

雖然植物嵌合體極具觀賞價(jià)值，但由于植物嵌合體的結(jié)構(gòu)特征很不穩(wěn)定，嵌合體性狀難以保持，在組織培養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)常會(huì)發(fā)生變異[10]。何業(yè)華等[4]、易清等[11]、呂秀立等[12]通過(guò)組織培養(yǎng)對(duì)植物嵌合體性狀穩(wěn)定性、變異規(guī)律及調(diào)控進(jìn)行了研究。研究表明，在不定芽分化誘導(dǎo)和增殖過(guò)程中，選擇能抑制愈傷組織的形成和分化，以及促進(jìn)腋芽分化和萌發(fā)的技術(shù)措施，能增強(qiáng)組織培養(yǎng)過(guò)程中嵌合體性狀的穩(wěn)定性[4]。王燕等[10]通過(guò)定芽途徑即從頂芽誘導(dǎo)叢生芽增殖和從去除頂芽的莖段誘導(dǎo)腋芽增殖，結(jié)果顯示叢生芽增殖方式增殖率高于腋芽增殖率，但叢生芽增殖方式的變異率更高，因此認(rèn)為腋芽增殖繁殖是保持嵌合體特性的離體快繁的最佳方式。激素高低也會(huì)影響嵌合體性狀的穩(wěn)定性，激素濃度越高，嵌合體的變異率越低，選擇合適的激素濃度也可以保持嵌合體性狀的穩(wěn)定性[12]。

1 材料與方法

1.1 材料 金心香龍血樹(shù)的葉片和莖段材料，來(lái)源于普洱學(xué)院小山坡發(fā)現(xiàn)的金心香龍血樹(shù)植株;金邊香龍血樹(shù)的葉片和莖段材料，來(lái)源于喜慶園林責(zé)任有限公司取材進(jìn)行香龍血樹(shù)組織培養(yǎng)研究培育出的金邊香龍血樹(shù)變異植株[3];金邊及金心香龍血樹(shù)不定芽增殖和愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的材料，來(lái)源于前兩者外植體經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生。

1.2 方法

1.2.1 外植體預(yù)處理 分別截取金心香龍血樹(shù)和金邊香龍血樹(shù)的葉片和莖段，把葉片表面清洗干凈，然后將葉片帶有黃色條紋狀的部分剪成長(zhǎng)3cm、寬2cm左右的方形，置于自來(lái)水下沖洗30min;洗凈莖段表面肉眼可見(jiàn)的臟物，重點(diǎn)清洗莖基部，然后置于自來(lái)水下沖洗30min。

1.2.2 外植體消毒與滅菌 葉片消毒滅菌：用酒精浸泡15s，然后在0.1%的升汞溶液下消毒滅菌9min，邊消毒邊震蕩，最后用滅菌過(guò)的蒸餾水沖洗4次。

莖段消毒滅菌：將金邊香龍血樹(shù)和金心香龍血樹(shù)的莖段，先用75%酒精浸泡20 s，再用0.1%的升汞溶液消毒滅菌9 min，最后用蒸餾水沖洗4次。

1.2.3 培養(yǎng)基的配方與外植體接種培養(yǎng) 培養(yǎng)基的配方為：MS+6-BA+NAA+2，4-D+IAA+0.5g/L活性炭，6-BA設(shè)置1、2、3、5mg/L 4個(gè)濃度，NAA設(shè)置0.1、0.2、0.5mg/L 3個(gè)濃度，2，4-D設(shè)置0.5mg/L 1個(gè)濃度，IAA設(shè)置0.2mg/L 1個(gè)濃度，7種培養(yǎng)基配方見(jiàn)表1。其中1～4號(hào)為初代愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基;5～7號(hào)為繼代增殖培養(yǎng)基。

葉片誘導(dǎo)培養(yǎng)：將消毒9min的金邊和金心香龍血樹(shù)的葉片切成0.5cm×1.0cm大小，然后分別接種到1、2、3、4共4種培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶3個(gè)葉片，觀察4種培養(yǎng)基中葉片愈傷組織的誘導(dǎo)效果。

不定芽增殖和愈傷組織誘導(dǎo)不定芽培養(yǎng)：選取金邊及金心香龍血樹(shù)組織培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織和不定芽接種于5、6、7三種培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接種1個(gè)培養(yǎng)材料，觀察愈傷組織和不定芽的培養(yǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)香龍血樹(shù)葉片愈傷組織的誘導(dǎo)效果 金心香龍血樹(shù)和金邊香龍血樹(shù)的葉片在1、2、3、4號(hào)培養(yǎng)基上均沒(méi)有產(chǎn)生愈傷組織（表2）。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)香龍血樹(shù)莖段愈傷組織的誘導(dǎo)效果 由表3可知，金邊香龍血樹(shù)莖段愈傷組織在3號(hào)培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率最高，為30%;其次是2號(hào)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率最高，為25%;1號(hào)和4號(hào)培養(yǎng)基誘導(dǎo)率最低，僅為10%。因此，金邊香龍血樹(shù)莖段愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為3號(hào)培養(yǎng)基。金心香龍血樹(shù)莖段在2號(hào)培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率最高，為40%;其次是3號(hào)和1號(hào)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率分別為30%和25%;4號(hào)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率最低，僅為10%。因此，金心香龍血樹(shù)莖段愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為2號(hào)培養(yǎng)基。誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織中，誘導(dǎo)愈傷組織上開(kāi)始分化出不定芽。

2.3 金邊及金心香龍血樹(shù)愈傷組織和不定芽繼代培養(yǎng) 通過(guò)莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)獲得了金邊和金心香龍血樹(shù)的愈傷組織和不定芽，其中發(fā)現(xiàn)金邊香龍血樹(shù)莖段誘導(dǎo)出的愈傷組織中，有正常愈傷組織（圖1d）和嵌合愈傷組織（僅有1個(gè)，圖1e）之分;在正常愈傷組織中誘導(dǎo)出綠色不定芽（圖1a），在嵌合愈傷組織上誘導(dǎo)出嵌合不定芽（圖1b）。金心香龍血樹(shù)莖段誘導(dǎo)出的愈傷組織均為正常愈傷組織（圖1f），分化出的均為綠色不定芽（圖1c）。

將已經(jīng)獲得金邊和進(jìn)行香龍血樹(shù)愈傷組織和不定芽材料進(jìn)行增殖，轉(zhuǎn)接至5～7號(hào)培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。由表4可以看出：金邊龍血樹(shù)正常愈傷組織在5號(hào)培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)形成芽最數(shù)最多為3.20±1.09;金邊香龍血樹(shù)嵌合體愈傷組織在7號(hào)培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)形成芽數(shù)最少為0.70±0.40;數(shù)據(jù)表明：5號(hào)培養(yǎng)基即MS+3.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5g/L活性炭可以誘導(dǎo)愈傷組織獲得更多不定芽。

由表5可以看出：金邊龍血樹(shù)綠色不定芽在7號(hào)培養(yǎng)基中芽增殖倍數(shù)最高為4.60±1.18個(gè);金邊龍血樹(shù)嵌合體不定芽在5號(hào)培養(yǎng)基中芽增殖倍數(shù)最高為2.60±0.65個(gè)。

圖2是在此次繼代實(shí)驗(yàn)中得到的金邊及金心香龍血樹(shù)綠色不定芽和嵌合體不定芽。如圖2a所示，是通過(guò)金邊不定芽增殖所得綠色不定芽，圖2b是由金邊嵌合不定芽增殖所得金邊葉色嵌合體不定芽，葉片邊緣為金黃色，保持了嵌合體性狀，圖2c是由金心不定芽增殖所得綠色不定芽（可能由于營(yíng)養(yǎng)缺乏，已經(jīng)開(kāi)始黃化），圖2d由金邊正常愈傷組織所得金邊正常綠色不定芽，圖2e由金邊嵌合體愈傷組織所得金邊葉色嵌合體不定芽，葉片邊緣為金黃色，保持了嵌合體性狀，圖2f是由金心正常愈傷組織所得正常綠色不定芽（可能由于營(yíng)養(yǎng)缺乏，已經(jīng)開(kāi)始黃化）。

經(jīng)過(guò)愈傷組織和不定芽繼代增殖后，有的金邊嵌合體愈傷后期死亡，有的嵌合愈傷分化出的不定芽仍為綠色，有的不定芽葉腋處分化的不定芽為綠色等原因，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，通過(guò)繼代增殖培養(yǎng)，獲得了22個(gè)保持金邊嵌合性狀的不定芽。

3 討論

耿開(kāi)友等[13]認(rèn)為植物的金心或金邊是一種嵌合體的后生突變現(xiàn)象，其金黃色物質(zhì)僅存在于芽端生長(zhǎng)點(diǎn)的細(xì)胞和莖的形成層之中，想要通過(guò)組織培養(yǎng)繁殖金邊虎尾蘭，必須以頂芽或側(cè)芽為外植體，利用叢生芽快繁途經(jīng)才能保持金邊性狀。因此，基于嵌合體特殊性考慮，應(yīng)首選用頂芽或側(cè)芽做為外植體。本研究的金邊香龍血樹(shù)材料來(lái)自組織培養(yǎng)中的變異株[3]，材料僅有一棵。金香龍血樹(shù)來(lái)源于普洱學(xué)院小山坡，僅有5株。劉和平等[14]用也門(mén)鐵（香龍血樹(shù)）葉片作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得了愈傷組織，最佳培養(yǎng)基配方是MS+0.5mg/L2，4-D+0.5mg/L NAA+1.0mg/L BA，誘導(dǎo)率達(dá)到44.4%。由于本研究的3號(hào)培養(yǎng)基和劉和平等[14]的最佳培養(yǎng)基配方一致，因此先以金邊和金心香龍血樹(shù)葉片作為外植體，但均未誘導(dǎo)出愈傷組織。而采用莖段為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，2種材料均誘導(dǎo)產(chǎn)生了愈傷組織。金心香龍血樹(shù)莖段產(chǎn)生的愈傷組織全部正常，金邊香龍血樹(shù)愈傷組織中僅有1個(gè)愈傷組織上分化出了嵌合體不定芽，可能是位于最靠近頂端分生組織的部位。

本研究通過(guò)初代培養(yǎng)和繼代增殖培養(yǎng)，獲得了22個(gè)保持金邊嵌合性狀的不定芽，為后續(xù)金邊嵌合性狀穩(wěn)定性研究奠定基礎(chǔ)。從本研究結(jié)果來(lái)看，莖段不適宜作為外植體開(kāi)展組織培養(yǎng)研究來(lái)保持嵌合性狀。在嵌合體不定芽資源充足情況下，應(yīng)選用頂芽誘導(dǎo)叢生芽和莖段腋芽增殖途徑進(jìn)行增殖，在適宜培養(yǎng)基誘導(dǎo)下，可對(duì)嵌合體進(jìn)行進(jìn)一步組培擴(kuò)繁研究。

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（責(zé)編：王慧晴）