汪艷 李晨輝 劉盛國(guó)

摘要：目的 ?探討肺泡灌洗液高通量測(cè)序在肺部感染的病原學(xué)診斷價(jià)值。方法 ?收集2019年2月～2020年3月深圳市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科送檢的37例肺部感染患者的檢測(cè)結(jié)果及臨床資料，分析患者的一般臨床資料及高通量測(cè)序在肺部感染性疾病中的檢測(cè)結(jié)果及臨床轉(zhuǎn)歸情況。結(jié)果 ?37例患者中男性多于女性，主要集中于<65歲年齡段，無(wú)吸煙史患者居多，多合并基礎(chǔ)疾病，以急性病程為主，CT表現(xiàn)為單肺病變和雙肺病變。肺泡灌洗液標(biāo)本中高通量病原體陽(yáng)性率高于常規(guī)培養(yǎng)（64.86% vs 24.32%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;兩者病原體報(bào)告時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。高通量測(cè)序檢出單一病原菌感染19例，混合感染5例，與微生物病原體一致且考慮致病菌8例，與常規(guī)微生物培養(yǎng)相比，其靈敏度為88.89%，特異度為42.86%。13例根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果調(diào)整了治療方案，臨床獲益。結(jié)論 ?肺泡灌洗液高通量測(cè)序?qū)Ψ尾扛腥镜牟≡w檢測(cè)較為敏感、診斷相對(duì)準(zhǔn)確，可提高肺部感染的病原體檢測(cè)陽(yáng)性率，尤其是對(duì)于混合及少見(jiàn)、罕見(jiàn)菌感染，對(duì)于臨床微生物標(biāo)本培養(yǎng)陰性的人群針對(duì)性地使用抗生素有一定的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：肺泡灌洗液;高通量測(cè)序;肺部感染;病原學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)：R446.5 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.23.047

文章編號(hào)：1006-1959（2020）23-0160-04

Abstract：Objective ?To investigate the etiological diagnostic value of high throughput sequencing of alveolar lavage fluid in pulmonary infection.Methods ?Collect the test results and clinical data of 37 patients with pulmonary infection sent by the Department of Respiratory and Critical Care Medicine of Shenzhen People's Hospital from February 2019 to March 2020，analyze the general clinical data of patients and the detection results and clinical outcomes of high-throughput sequencing in pulmonary infectious diseases.Results ?Among the 37 patients， there were more males than females， mainly in the age group <65 years old. The majority of patients had no history of smoking， and most of them had underlying diseases， mainly with acute course. CT showed single lung disease and double lung disease. The positive rate of high-throughput pathogens in alveolar lavage fluid specimens was higher than that in conventional culture （64.86% vs 24.32%）， the difference was statistically significant （P<0.05）; the comparison of the pathogen reporting time between the two was not statistically significant （P>0.05）. High-throughput sequencing detected 19 cases of single pathogen infection and 5 cases of mixed infection， which were consistent with microbial pathogens and 8 cases of pathogenic bacteria were considered. Compared with conventional microbial culture， the sensitivity was 88.89% and the specificity was 42.86%. The treatment plan was adjusted in 13 cases based on the results of high-throughput sequencing， and the clinical benefit was achieved.Conclusion ?High-throughput sequencing of alveolar lavage fluid is more sensitive and accurate for the detection of pathogens in pulmonary infection， which can improve the positive rate of pathogen detection in pulmonary infection， especially for mixed and rare and rare bacterial infections. It has certain reference value for the population with negative culture of clinical microbial specimens to use antibiotics.

Key words：Alveolar lavage fluid;High-throughput sequencing;Pulmonary infection;Etiology

肺部感染（pulmonary infection）是指包括終末氣道、肺泡腔及肺間質(zhì)在內(nèi)的肺實(shí)質(zhì)炎癥，病因以感染最為常見(jiàn)，還可由理化、免疫及藥物引起，其臨床表現(xiàn)、影像學(xué)及感染的病原體種類(lèi)均存在多樣性，往往不能通過(guò)一些常見(jiàn)的輔助檢查和臨床表現(xiàn)來(lái)確定感染的病原體。當(dāng)肺部感染的病原體診斷不夠明確時(shí)，尤其是重癥患者，如不能夠針對(duì)性的采取藥物進(jìn)行治療，則可能耽誤病情，導(dǎo)致治療不及時(shí)引起死亡[1]。此外，臨床上以滲出或?qū)嵶優(yōu)楸憩F(xiàn)的肺部非感染性疾病越來(lái)越多見(jiàn)，如肺炎型肺癌、放射性肺炎、肺栓塞等，臨床診治困難。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)，又稱(chēng)二代測(cè)序技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)在短時(shí)間內(nèi)對(duì)一個(gè)物種的基因組、轉(zhuǎn)錄組和宏基因組進(jìn)行深入全面的分析，通過(guò)序列分析掌握病原微生物群體組成情況。與傳統(tǒng)病原檢測(cè)方法相比，高通量測(cè)序技術(shù)能夠一次性檢測(cè)獲得樣品中可能感染的多種病原物基因組序列，對(duì)明確混合感染以及少見(jiàn)、罕見(jiàn)或新發(fā)病原體感染具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[2]。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，高通量測(cè)序越來(lái)越多的用于臨床感染性疾病診治、傳染病病原體檢測(cè)等方面。支氣管肺泡灌洗可以獲得氣管鏡所不能探及下氣道的細(xì)胞和溶質(zhì)，能更全面的反映肺部的整體情況?；诟咄繙y(cè)序的支氣管肺泡灌洗液的研究可以更加準(zhǔn)確全面地反應(yīng)下呼吸道微生物群的存在，對(duì)肺部感染的診斷具有重要的意義。本研究結(jié)合2019年2月～2020年3月深圳市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科送檢的37例高通量測(cè)序患者的肺泡灌洗液樣本結(jié)果及臨床資料，探討肺泡灌洗液高通量測(cè)序在肺部感染的病原學(xué)診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料 ?回顧性分析2019年2月～2020年3月深圳市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科送檢賽哲生物基因檢測(cè)公司進(jìn)行基因測(cè)序的37例肺部感染患者的檢測(cè)結(jié)果及臨床資料，所有患者CT表現(xiàn)為滲出或?qū)嵶?，均由兩名影像學(xué)醫(yī)生及一名呼吸科臨床醫(yī)生共同評(píng)估判定。

1.2方法

1.2.1資料收集 ?收集患者一般資料及影像資料，包括性別、年齡、基礎(chǔ)疾病、吸煙史、病程及CT表現(xiàn)。1.2.2肺泡灌洗液高通量測(cè)序 ?采集患者的肺泡灌洗液標(biāo)本，送檢賽哲生物基因檢測(cè)公司進(jìn)行高通量測(cè)序（使用illumina nextseq 550 DX測(cè)序平臺(tái)，肺泡灌洗液≥5ml，快速低溫保存，冷鏈運(yùn)輸-20℃以下，對(duì)于肺泡灌洗液樣本的高通量測(cè)序程序包括核酸提取、文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序和信息分析），同時(shí)送檢我院肺泡灌洗液病原學(xué)培養(yǎng)和（或）肺組織培養(yǎng)及痰培養(yǎng)，記錄病原體的情況。

1.3診斷標(biāo)準(zhǔn) ?繼發(fā)性肺結(jié)核：痰涂抗酸桿菌或抗酸桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性;肺組織病理學(xué)診斷結(jié)核;按中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核分會(huì)制定的肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為菌陰肺結(jié)核。肺曲霉球：金標(biāo)準(zhǔn)為組織真菌培養(yǎng)陽(yáng)性或組織病理學(xué)確診曲霉感染。肺隱球菌?。航饦?biāo)準(zhǔn)為病原學(xué)涂片和培養(yǎng)、組織病理檢查。血清隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)具有快速診斷價(jià)值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 ?采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用？字2檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般臨床資料 ?37例患者中男性多于女性，主要集中于<65歲年齡段，無(wú)吸煙史患者居多，多合并基礎(chǔ)疾病，以急性病程為主，CT表現(xiàn)為單肺病變何雙肺病變，見(jiàn)表1。

2.2高通量測(cè)序在肺部感染性疾病中的檢測(cè)結(jié)果及臨床轉(zhuǎn)歸情況

2.2.1肺泡灌洗液高通量測(cè)序與常規(guī)培養(yǎng)兩種方法的病原體陽(yáng)性率及病原體報(bào)告時(shí)間比較 ?37例高通量測(cè)序中，檢出病原體30例，結(jié)合臨床、CT及病原菌培養(yǎng)，陽(yáng)性病原體24例，假陽(yáng)性病原體9例，3例臨床不能排除。37例常規(guī)微生物培養(yǎng)中，檢出病原體13例，結(jié)合臨床及CT表現(xiàn)，陽(yáng)性9例。肺泡灌洗液標(biāo)本中高通量病原體陽(yáng)性率高于常規(guī)培養(yǎng)（64.86% vs 24.32%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;兩者病原體報(bào)告時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

2.2.2高通量病原體檢測(cè)結(jié)果 ?24例陽(yáng)性結(jié)果中單一病原菌感染19例（細(xì)菌18例、病毒0例、真菌1例），其中細(xì)菌感染分別為流感嗜血桿菌3例、肺炎鏈球菌4例、肺炎支原體1例、銅綠假單胞菌4例、肺炎克雷伯菌1例、金黃色葡萄球菌1例、鮑曼不動(dòng)桿菌1例、伯克霍爾德菌1例、產(chǎn)黑普雷沃菌1例、玫瑰單胞菌屬1例，真菌感染以互格交鏈鏈格孢為主;混合感染5例（細(xì)菌合并病毒2例、細(xì)菌合并真菌2例，細(xì)菌合并結(jié)核1例），其中細(xì)菌合并病毒感染分別為流感嗜血桿菌+人類(lèi)乳頭瘤病毒（HPV）49 1例、銅綠假單胞菌+（巨細(xì)胞病毒）CMV 1例，細(xì)菌合并真菌感染分別為嗜麥芽窄單胞菌+熱帶假絲酵母1例、伯克霍爾德菌+白色念珠菌1例，細(xì)菌合并結(jié)核感染為諾卡菌屬+結(jié)核分枝桿菌1例。9例不相符病例，其中繼發(fā)性肺結(jié)核2例，肺曲霉菌球1例，肺隱球菌病1例。

2.2.3高通量測(cè)序與常規(guī)微生物檢查陽(yáng)性結(jié)果的一致性比較 ?常規(guī)微生物培養(yǎng)檢出13例，陽(yáng)性9例，其中高通量測(cè)序與微生物檢測(cè)一致且考慮致病菌共8例，1例培養(yǎng)化膿諾卡菌（致病菌），高通量測(cè)序檢出洋蔥伯克霍爾德菌見(jiàn)表3。肺泡灌洗液NGS與常規(guī)微生物培養(yǎng)相比，其靈敏度為88.89%（8/9），特異度42.86%（12/28），見(jiàn)表4。

2.2.4高通量測(cè)序與臨床抗生素方案調(diào)整 ?37例患者中有13例患者根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果調(diào)整了治療方案，特殊包括高通量測(cè)序陽(yáng)性及常規(guī)陰性的肺炎支原體1例、玫瑰單胞菌1例、互格交鏈鏈格孢1例，分別調(diào)整治療方案為左氧氟沙星、美羅培南、伏立康唑;而高通量測(cè)序及常規(guī)均陽(yáng)性的鮑曼不動(dòng)桿菌1例、諾卡菌屬1例，其高通量測(cè)序陽(yáng)性結(jié)果檢出時(shí)間早于常規(guī)培養(yǎng)，提前調(diào)整抗生素方案指導(dǎo)臨床治療。

3討論

肺部感染是臨床常見(jiàn)的一種呼吸道感染性疾病，尤其是重癥肺炎患者，往往病原菌相對(duì)復(fù)雜，治療難度大大增加[3]，易引起較為嚴(yán)重的并發(fā)癥甚至死亡。目前傳統(tǒng)檢測(cè)方法標(biāo)本的陽(yáng)性培養(yǎng)率偏低，增加了臨床診療工作的難度。因此不依賴(lài)于微生物培養(yǎng)及常規(guī)臨床檢測(cè)的高通量病原菌診斷技術(shù)越來(lái)越受關(guān)注。

高通量測(cè)序適用于現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)無(wú)法鑒別的病原體的檢測(cè)，也適用于患者對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化的抗生素治療無(wú)反應(yīng)的情況。對(duì)于罕見(jiàn)和生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌，高通量測(cè)序在縮短確診細(xì)菌/真菌感染所需的時(shí)間、促進(jìn)靶向抗菌治療和改善患者預(yù)后方面具有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)[4]。劉孝榮等[5]針對(duì)兒童重癥肺部感染肺泡灌洗液應(yīng)用高通量測(cè)序檢測(cè)病原體的研究中發(fā)現(xiàn)，高通量測(cè)序的靈敏度較高（86.84%），能檢出未知病原菌，優(yōu)于傳統(tǒng)的臨床檢驗(yàn)方法。Liu J等[6]對(duì)危重患者進(jìn)行支氣管肺泡灌洗液高通量測(cè)序檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與培養(yǎng)法比較，高通量測(cè)序診斷敏感性為88.89%，特異性為74.07%。任迪等[7]研究也提示，肺泡灌洗液及血高通量測(cè)序檢測(cè)方法對(duì)比，肺泡灌洗液高通量測(cè)序意義更大。本研究中主要針對(duì)非重癥肺部感染患者的肺泡灌洗液高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，同樣得出肺泡灌洗液高通量測(cè)序檢出病原體陽(yáng)性率高于常規(guī)微生物培養(yǎng)的結(jié)論，其靈敏度為88.89%，但特異度為42.86%，考慮可能與以下方面相關(guān)：①亞急性和慢性病程者較多，多數(shù)患者曾反復(fù)多次使用抗生素治療，常規(guī)培養(yǎng)陽(yáng)性率低，而高通量測(cè)序檢測(cè)肺泡灌洗液中可檢測(cè)病原微生物群體基因片段，其高通量測(cè)序的陽(yáng)性病例常規(guī)培養(yǎng)陰性病例明顯增多，而兩者陰性病例則減少。②樣本病例數(shù)偏少，且非重癥肺部感染的程度不同可能引起數(shù)據(jù)結(jié)果的偏移，導(dǎo)致特異度降低。

國(guó)外研究報(bào)道[8，9]，多重微生物感染在社區(qū)獲得性肺炎患者中約占6%～13%，其中以?xún)煞N細(xì)菌感染或一種細(xì)菌合并另一種非典型病原體感染多見(jiàn)。Wang J等[10]研究發(fā)現(xiàn)，高通量測(cè)序診斷混合肺部感染的敏感性為97.2%，特異性為63.2%，真菌的陽(yáng)性檢出率為56.4%，提示高通量測(cè)序是檢測(cè)混合性肺部感染病原體的有效方法，特別是合并真菌感染，具有快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)。本研究中合并基礎(chǔ)疾病21例，以腫瘤、結(jié)構(gòu)性肺病、代謝性疾病為主，多為免疫低下人群，易合并復(fù)雜、罕見(jiàn)及少見(jiàn)菌感染，其中混合感染5例，覆蓋細(xì)菌、病毒、真菌等，經(jīng)對(duì)癥治療臨床獲益;罕見(jiàn)及少見(jiàn)菌2例，玫瑰單胞菌屬1例、互格交鏈鏈格孢1例，兩者多為條件致病菌，合并肺部感染相對(duì)少見(jiàn)，對(duì)微生物鏡檢和培養(yǎng)技術(shù)要求高，本身缺乏特異性，存在早期診斷率低的特點(diǎn)，針對(duì)這兩種病原菌調(diào)整治療方案后患者臨床癥狀明顯改善。而本研究中1例肺隱球菌病，1例諾卡菌合并結(jié)核感染，2例繼發(fā)性肺結(jié)核，前者高通量測(cè)序未檢出，后者僅檢出諾卡菌，未檢出結(jié)核分枝桿菌，考慮高通量測(cè)序?qū)﹄[球菌及結(jié)核分枝桿菌檢出率較低，可能與隱球菌本身存在的肥厚莢膜及結(jié)核桿菌細(xì)胞壁特殊，難以像其他細(xì)菌通過(guò)去污或裂解劑裂解導(dǎo)致破壁不充分等有關(guān)，最終影響檢測(cè)結(jié)果。

另外，本研究中37例患者中有13例患者改變了治療策略，高通量測(cè)序的有限價(jià)值可能是因?yàn)榉侵匕Y社區(qū)獲得性肺炎患者常規(guī)經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療方案能夠覆蓋可能病原菌，無(wú)需進(jìn)一步調(diào)整，且往往針對(duì)病毒感染，標(biāo)準(zhǔn)化抗病毒治療通常在CT表現(xiàn)及臨床高度懷疑情況下提前使用。本研究中高通量測(cè)序與微生物檢測(cè)一致且考慮致病菌共8例，考慮常規(guī)方法與高通量測(cè)序之間的高符合率進(jìn)一步驗(yàn)證了高通量測(cè)序的有效性和準(zhǔn)確性。對(duì)于檢測(cè)能力有限的醫(yī)院，根據(jù)當(dāng)?shù)氐牧餍胁W(xué)特征，特別是對(duì)于免疫力低下的患者和有嚴(yán)重或復(fù)雜感染的患者，高通量測(cè)序則可作為推薦檢測(cè)手段[11-14]。然而本研究受到樣本數(shù)量少和疾病多樣性的限制，仍提示高通量測(cè)序存在自身局限性，首先判斷所檢出的微生物為致病菌還是定植菌，往往需要醫(yī)生結(jié)合臨床進(jìn)行綜合判斷。其次，不同檢測(cè)平臺(tái)微生物數(shù)據(jù)庫(kù)譜不同，結(jié)果也不盡相同，可能會(huì)導(dǎo)致一些罕見(jiàn)少見(jiàn)病原體難以測(cè)出。同時(shí)本研究亦沒(méi)有進(jìn)行耐藥基因的檢測(cè)，雖然目前高通量測(cè)序已被廣泛接受用于臨床感染性疾病診治、傳染病病原體檢測(cè)，但由于缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)臨床治療策略，尤其對(duì)于一些疑難病例，限制了其在臨床研究中的應(yīng)用。

綜上所述，肺泡灌洗液高通量測(cè)序?qū)Ψ尾扛腥镜牟≡w檢測(cè)較為敏感、診斷相對(duì)準(zhǔn)確，可提高肺部感染的病原體檢測(cè)陽(yáng)性率，尤其是對(duì)于混合及少見(jiàn)、罕見(jiàn)菌感染，對(duì)于臨床微生物標(biāo)本培養(yǎng)陰性的人群針對(duì)性地使用抗生素有一定的參考價(jià)值。

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收稿日期：2020-08-04;修回日期：2020-09-03

編輯/劉歡