譚 雄，陳 潔，畢國(guó)善，申 昕，戴先鵬，顏紅霞

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院 血管疝兒童普外科， 湖南 衡陽(yáng) 421000)

骨肉瘤(osteosarcoma)是一種常見(jiàn)的兒童惡性骨腫瘤，具有局部侵襲性及較高的轉(zhuǎn)移率，早期就可轉(zhuǎn)移至全身非骨骼器官，尤其是肺部[1-2]。目前，臨床針對(duì)骨肉瘤患者通常采用手術(shù)聯(lián)合化療的治療方案。盡管能夠在一定程度上改善患者病情，但其中20%的原發(fā)轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者5年生存率僅為30%～40%[3]。因此，尋找能夠有效抑制骨肉瘤原發(fā)灶轉(zhuǎn)移的治療方法，對(duì)于控制骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。

紅景天甙(salidroside, Sal)是提取自中草藥紅景天根莖中的天然提取物。大量研究證實(shí)[4]，Sal具有廣泛的生物學(xué)功能，如抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老、抗缺氧、增強(qiáng)免疫功能、雙向調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及修復(fù)和保護(hù)機(jī)體等。尤其是在抗腫瘤方面，Sal能夠有效抑制胃癌細(xì)胞增值并誘導(dǎo)其凋亡[5]。此外，Sal作用于肝癌細(xì)胞后，同樣能夠發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用[6]。然而，Sal對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系增殖以及上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的作用目前尚無(wú)報(bào)道。因此，本研究擬通過(guò)觀察Sal對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系增殖、凋亡以及EMT的影響，初步探究其作用機(jī)制，以期為骨肉瘤的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：骨肉瘤細(xì)胞系HOS和U2OS細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))。

1.1.2 試劑及試劑盒：紅景天甙(南京格爾狄生物科技有限公司)；MTT試劑(北京索萊寶科技有限公司)；Annexin-V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(北京碧云天生物技術(shù)公司)；抗Bcl-2、Bak、β-actin、E-cadherin、N-cadherin、Slug及Snial抗體(Cell Signaling Technology公司)；Transwell小室(上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司)；LY294002(Santa Cruz公司)；RPMI1640和胎牛血清等細(xì)胞培養(yǎng)試劑(上海生物工程股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與處理：將HOS和U2OS細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，且在培養(yǎng)基中加入1%的青霉素-鏈霉素。加入培養(yǎng)基后細(xì)胞于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時(shí)，更換新的RPMI 1640培養(yǎng)基。隨后用50, 100 以及150 μmol/L的Sal處理細(xì)胞24 h。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：待HOS和U2OS細(xì)胞增殖至80%左右時(shí)，以3×104個(gè)/mL的細(xì)胞加至96孔板，每孔150 μL。在各個(gè)細(xì)胞孔中加入不同濃度的Sal，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后在各孔中分別加入15 μL的MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。最后于酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)各孔的吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞活性。

1.2.3 流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：收集經(jīng)過(guò)Sal處理后的HOS和U2OS細(xì)胞。用含1%牛血清白蛋白的PBS緩沖液沖洗固定細(xì)胞，并于1 000 r/min離心10 min。隨后用100 μL 上樣緩沖液重懸細(xì)胞，并充分振蕩混勻。混勻后加入10 μL annexin V-FITC和10 μL的聚酰亞胺(polyimide，PI)溶液，37 ℃避光反應(yīng)15 min后加入50 μg/mL的碘化丙啶進(jìn)行染色。最后于流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 Transwell小室法檢測(cè)遷移：基質(zhì)凝膠用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋后，取40 μL加入至Transwell小室中，涂抹均勻后孵育24 h。第2天，將含無(wú)血清培養(yǎng)基的HOS和U2OS細(xì)胞加至上層Transwell小室中，下層加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。孵育24 h后細(xì)胞于無(wú)水乙醇中固定，并加入蘇木精-伊紅染色(HE) 15 min。最后在倒置顯微鏡下，對(duì)進(jìn)入濾膜下表面的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以評(píng)估細(xì)胞遷移能力。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：將長(zhǎng)勢(shì)良好的HOS以及和U2OS細(xì)胞(8×104個(gè)/孔)接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞增殖至95%左右時(shí)，每個(gè)孔都用200 μL無(wú)菌移液器槍頭進(jìn)行劃傷。吸去懸浮的細(xì)胞并用PBS清洗2遍，隨后加入150 μmol/L的Sal 37 ℃孵育24 h。拍下圖片后，利用ImageJ軟件分析了每條劃痕兩邊緣之間的距離。

1.2.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：收集經(jīng)Sal處理后HOS和U2OS的細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液后4 ℃反應(yīng)30 min，6 000 r/min離心30 min后收集上清。BCA法檢測(cè)蛋白濃度后，取10 μL蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，并于電轉(zhuǎn)膜儀中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，隨后加入相應(yīng)的一抗4 ℃孵育過(guò)夜，再加入稀釋好的二抗室溫孵育2 h?？贵w孵育完成后加入ECL發(fā)光液，并于顯影儀中進(jìn)行顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Sal抑制HOS和U2OS細(xì)胞增殖

用50、100 或150 μmol/L Sal處理24 h后，HOS和U2OS細(xì)胞的活力均顯著降低，且與Sal的刺激劑量呈正比(圖1)。

*P<0.05 compared with 0 μmol/L group圖1 Sal對(duì)HOS和U2OS細(xì)胞增殖的影響Fig 1 Effects of salidroside on the proliferation of HOS and U2OS n=3)

2.2 Sal誘導(dǎo)HOS和U2OS細(xì)胞凋亡

不同濃度Sal處理48 h后，HOS和U2OS細(xì)胞的凋亡率顯著增高(圖2A，表1)。而Sal處理的HOS和U2OS細(xì)胞中同時(shí)存在Bcl-2表達(dá)的降低，以及Bak表達(dá)增高(圖2B)。

2.3 Sal抑制HOS和U2OS細(xì)胞侵襲與遷移

不同濃度Sal處理24 h后，能夠顯著減少HOS和U2OS細(xì)胞的遷移水平(圖3A)。Sal處理HOS或U2OS細(xì)胞后，細(xì)胞侵襲率均明顯降低(圖3B)。

2.4 Sal抑制PI3K/Akt通路，抑制EMT分子表達(dá)

用不同濃度Sal處理后，Akt磷酸化水平明顯降低(圖4A)。用150 μmol/L Sal處理后，HOS和U2OS 細(xì)胞中均出現(xiàn)EMT相關(guān)分子E-cadherin表達(dá)上調(diào)，N-cadherin、Slug和Snial表達(dá)下調(diào)。PI3K/Akt抑制劑處理細(xì)胞后的結(jié)果顯示，與Sal單獨(dú)處理的細(xì)胞相比，20 μmol/L PI3K/Akt抑制劑LY294002處理的HOS和U2OS 細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)水平顯著降低，而N-cadherin、Slug和Snial的表達(dá)水平有所增高(圖4B)。

表1 Sal對(duì)HOS和U2OS細(xì)胞凋亡率的影響

3 討論

Sal是草本植物紅景天的主要成分，具有抗腫瘤、抗氧化等生物學(xué)活性，是目前抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)之一。本研究通過(guò)檢測(cè)HOS和U2OS細(xì)胞的細(xì)胞活性以及凋亡水平，證實(shí)了Sal對(duì)骨肉瘤HOS和U2OS細(xì)胞增殖的抑制作用，以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。

腫瘤轉(zhuǎn)移涉及細(xì)胞的多種生物學(xué)功能，其中就包括侵襲與遷移。而細(xì)胞的侵襲與遷移往往也是惡性腫瘤從原組織向鄰近的宿主組織擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[7-8]。研究表明[9]，Sal可通過(guò)下調(diào)STAT3下游靶蛋白MMP2及MMP9的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制人結(jié)腸癌SW116細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程。本研究通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲與遷移情況。結(jié)果顯示，其侵襲與遷移水平受到明顯抑制。進(jìn)一步證實(shí)Sal可以抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移。

A.HOS and U2OS apoptosis was detected by flow cytometry; B.expression levels of apoptotic proteins in HOS and U2OS cells were detected by Western blot; *P<0.05 compared with the 0 μmol/L group

腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散至其他組織器官除了涉及細(xì)胞的侵襲與遷移過(guò)程外，通常還與細(xì)胞的EMT過(guò)程密切相關(guān)[10]。EMT的主要特征包括細(xì)胞黏附分子(如E-cadherin)表達(dá)的減少， EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(Slug和Snial)表達(dá)增加[11]。此外，大量研究證實(shí)[12]， 腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT不僅能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲的作用，而且還能顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗凋亡作用。本研究通過(guò)Sal處理HOS和U2OS 細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)E-cadherin表達(dá)上調(diào)，N-cadherin、Slug和Snial表達(dá)下調(diào)，提示細(xì)胞EMT受抑制。而由于EMT的抑制將直接影響細(xì)胞的增殖，這就可以解釋為什么Sal對(duì)HOS和U2OS 細(xì)胞增殖也存在抑制作用。

A.invasion level of HOS and U2OS cells(×40); B.Migration level of HOS and U2OS cells(×100); *P<0.05 compared with the 0 μmol/L group; #P<0.05 compared with the 24 hours group

A.level of Akt in HOS and U2OS cells was detected by Western blot; B.levels of EMT related molecules in HOS and U2OS cells was detected by Western blot; *P<0.05 compared with the 0 μmol/L group; #P<0.05 compared with the 150 μmol/L Sal group

PI3K/Akt是一種重要的胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，能夠參與多種細(xì)胞生理活動(dòng)的調(diào)控[13]。采用其抑制劑處理細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HOS和U2OS 細(xì)胞EMT水平顯著降低，充分說(shuō)明Sal抑制骨肉瘤細(xì)胞EMT過(guò)程與PI3K/Akt通路抑制有關(guān)。但是其具體通過(guò)哪些上游分子發(fā)揮作用，尚不清楚，仍需進(jìn)一步明確。

綜上所述，本研究初步證實(shí)Sal能夠顯著抑制骨肉瘤HOS以及U2OS 細(xì)胞的增殖、侵襲以及遷移能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。此外，其還能夠通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路抑制骨肉瘤HOS以及U2OS細(xì)胞發(fā)生EMT。這為進(jìn)一步明確骨肉瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制，從而開(kāi)發(fā)有效的治療藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。