駱時木， 歐陽航， 蔣燕成， 張志珊

(福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院 檢驗科， 福建 泉州 362000)

心血管疾病尤其是冠心病(coronary heart disease, CHD)的發(fā)病率在糖尿病(diabetes mellitus, DM)人群中明顯增高，它是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)最為常見的并發(fā)癥，同時也是糖尿病患者的常見死亡原因。據(jù)相關研究報道，糖尿病患者由于冠心病所引發(fā)的病死率比非糖尿病患者高2～4倍[1]。但目前有關2型糖尿病增加冠心病患病風險的機制尚未完全闡明。研究表明，T2DM合并CHD有明顯家族及種族會集性，其發(fā)病風險中遺傳因素起著重要的作用，許多與T2DM患病風險相關的基因位點同時與冠心病的高風險相關[2]。

在眾多易感基因中，TCF7L2是目前發(fā)現(xiàn)的與2型糖尿病相關性最強的基因[3-7]，但其與T2DM合并CHD發(fā)病風險的相關性國內研究較少。在TCF7L2基因眾多SNP位點中，rs7903146、rs12255372、rs290487、rs11196205、rs290481被認為與T2DM易感性有關。TCF7L2 rs290481基因多態(tài)性可能影響胰島β細胞胰島素分泌功能，從而引起血糖升高[4]，被認為與T2DM發(fā)生相關，但目前尚無rs290481多態(tài)性與T2DM合并CHD發(fā)病風險的相關性報道。本文探討TCF7L2基因rs290481位點單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNPs)與2型糖尿病合并冠心病發(fā)病風險的相關性，以期為2型糖尿病易患冠心病的高危人群提供預警，為臨床動脈粥樣硬化性心血管病的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：選取2017年12月到2018年6月福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院臨床患者和健康體檢人群作為研究對象，共480例，且已排除家系(血緣)關系。對照組120例均經有關檢查排除冠心病，同時無高血壓、糖尿病等病史。T2DM組120例為內分泌科就診并診斷為2型糖尿病的患者，其診斷初期口服降糖藥物治療有效，全部患者采用飲食或藥物控制血糖，未使用胰島素治療，無CHD病史及其他并發(fā)癥。CHD組為選擇同期在心內科因CHD住院的患者120例，具有符合冠脈造影檢查證實冠脈狹窄≥50%者，或者既往有明確心肌梗死病史者，無DM病史及其他并發(fā)癥。T2DM+CHD組120例為同期心內科因冠心病住院的2型糖尿病患者，冠心病和2型糖尿病診斷標準同上。

本研究得到了醫(yī)院倫理委員會的批準(泉-倫[2017]147號)，所有受試者均在實驗前了解本實驗的目的并簽署知情同意書。

1.1.2 試劑：生化測定試劑盒(貝克曼公司)；HbAlc檢測試劑盒(日本愛科來公司)；全血DNA提取試劑盒 (Qiagen公司)；引物合成和Taq聚合酶[TaKaRa寶生物工程(北京)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 標本的收集和保存：禁食12～14 h后，于次日清晨采靜脈血2管。其中1管不抗凝血3 mL，分離血清后用于生化指標檢測；而另1管EDTA-K3抗凝血3 mL，其中1 mL用于糖化血紅蛋白測定(HbAlc)，剩余標本用于提取基因組DNA。

1.2.2 生化指標檢測：高效液相色譜法檢測HbAlc。全自動生化分析儀測定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、ApoA和ApoB。葡萄糖氧化酶法測定血糖，酶法測定TC、TG、HDL-C和LDL-C，免疫法測定ApoA和ApoB。實驗均嚴格按照標準操作規(guī)程進行操作檢驗，用高低兩個水平配套質控品進行質量控制。

1.2.3 基因多態(tài)性的檢測：QIAGEN試劑提取外周血DNA，超微量紫外可見分光光度計檢測其DNA濃度及純度。在NCBI數(shù)據(jù)庫上下載目標SNP位點上下500 bp的基因序列，用引物設計軟件primer premier5.0設計下列引物：TCF7L2-rs290481(409 bp)：上游引物:5′-CAGTGACATTGTCTGACAGTGG-3′(22 bp)，下游引物:5′-ACTAATTTTGCCCTGCACCAA-3′(21 bp)。引物由TaKaRa合成。PCR反應總體積30 μL，包括10×緩沖液3 μL，dNTP 2.4 μL，正向引物和反向引物各0.6 μL，模板DNA 1.5 μL，Taq酶0.15 μL及ddH2O 21.75 μL。PCR循環(huán)條件：95 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，57.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共進行35次循環(huán)；最后延伸72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物用3%的瓊脂糖凝膠電泳，EB(溴化乙錠)染色，凝膠成像儀觀察結果，以DL500 DNA marker作為參照。擴增產物由北京六合華大基因科技有限公司進行測序，Chromas軟件分析測序結果。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 一般臨床資料

4組研究對象的一般臨床資料比較(表1)。與正常對照組相比較，T2DM組、CHD組、T2DM+CHD組BMI、收縮壓、舒張壓和HbAlc水平均高于對照組，而 HDL-C、ApoA和ApoB水平低于對照組(P<0.05)， T2DM組GLU、TC、TG和LDL-C高于對照組(P<0.05)，T2DM+CHD組GLU、TG高于對照組(P<0.05)。

與T2DM組比較，CHD組、T2DM+CHD組收縮壓、HbAlc低于T2DM組，T2DM+CHD組BMI、TC、HDL-C、LDL-C和ApoA低于T2DM組(P<0.05)。

與CHD組比較，T2DM+CHD組的收縮壓、HbAlc、GLU和TG大于CHD組，HDL-C、ApoA水平低于CHD組(P<0.05)。

2.2 4組研究對象TCF7L2 rs290481基因多態(tài)性基因型頻率的分布

TCF7L2 rs290481基因多態(tài)位點在對照組(χ2=0.700)、T2DM組(χ2=4.247)、CHD組(χ2=3.333)及T2DM+CHD組(χ2=1.864)基因型頻數(shù)分布均符合 Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，所研究的基因型頻數(shù)和預期的基因型頻數(shù)相符合，具有群體代表性。

對照組與T2DM組、對照組與CHD組、T2DM組與CHD組、T2DM組與T2DM+CHD組、CHD組與T2DM+CHD組的基因型分布頻率均存在顯著性差異(P<0.05)(表2)。

2.3 TCF7L2 rs290481各基因型之間生化水平比較

TCF7L2 rs290481基因位點AA基因型HbAlc、GLU水平高于AG+GG基因型(P<0.05)。各組內TCF7L2 rs290481 基因型與各生化指標沒有相關性(表3)。

2.4 T2DM合并CHD危險因素的二分類Logistic回歸分析

將全部研究對象作為整體進行二分類Logistic回歸分析。二分類劃分標準如下：性別(女性為0，男性為1)；年齡(<60歲為0，≥60歲為1)； 高血壓病史(無為0，有為1)；BMI(<24 kg/m2為0，≥24 kg/m2為1)；rs290481基因型(AA為0，AG+GG為1)等作為自變量(X)；血脂按照《中國成人血脂異常防治指南》，將血脂分層切點分為不同的等級：TC(<5.18 mmol/L為0，≥5.18 mmol/L為1)；TG(<1.70 mmol/L為0，≥1.70 mmol/L為1)；HDL-C(≥1.04 mmol/L為0，<1.04 mmol/L為1)；LDL-C(<3.37 mmol/L為0，≥3.37 mmol/L為1)；GLU(<6.11 mmol/L為0，≥6.11 mmol/L為1)；HbAlc(<6.0%/L為0，≥6.0%為1)分別將是否有2型糖尿病(否為0，有為1),是否有冠心病(否為0，有為1)和是否有T2MD合并CHD(否為0，有為1)作為因變量(Y)，其他指標作為自變量(X)。分別校正年齡、性別等相關因素后，分析結果顯示：高血壓病史(OR=4.136)、HbAlc(OR=697.561)、Glu(OR=85.555)是本研究對象中發(fā)生2型糖尿病的獨立危險因素；BMI(OR=1.929)、高血壓病史(OR=3.537)是發(fā)生冠心病的獨立危險因素；高血壓病史(OR=2.121)、HbAlc(OR=22.606)、GlU(OR=9.023)是發(fā)生T2DM合并CHD的獨立危險因素，HDL-C是預防冠心病(OR=4.049)和T2DM合并CHD(OR=2.764)的保護因素；rs290481基因型是發(fā)生冠心病的獨立危險因素(OR=3.303)，同時也是發(fā)生T2DM合并CHD的獨立危險因素(OR=4.291)。

表1 4組研究對象一般臨床資料比較Table 1 Comparison of general clinical data in four

表2 4組研究對象組TCF7L2 rs290481基因型及等位基因頻率分布的比較Table 2 Comparison of genotype and allele frequency distribution of TCF7L2 rs290481 in four groups

表3 所有研究對象TCF7L2 rs290481各基因型間生化項目比較Table 3 Comparison of biochemical items between genotype AA and AG/GG of rs290481 in all research objects

3 討論

TCF7L2編碼產物是Wnt信號通路的關鍵蛋白，Wnt信號通路通過促進腸道內分泌L細胞分泌胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)，在調節(jié)血糖穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用[8]。TCF7L2多態(tài)性可能通過間接減少腸內分泌細胞GLP-1的分泌，增加2型糖尿病患病風險[9]。

TCF7L2 rs290481基因多態(tài)性與T2DM的相關性國內報道并不一致。本研究rs290481位點共檢測到177個AG雜合型突變、106個GG純合型突變，突變率為58.9%，與福州地區(qū)結果相近[10]。T2DM組rs290481 AA、AG、GG基因型分布頻率與正常組、CHD組和T2DM+CHD組比較均有顯著性差異，但不是T2DM的獨立危險因素，與國內的報道并不完全一致[11-13]。這可能與地域差異有關。另一方面，本研究結果顯示rs290481位點與CHD、T2DM合并CHD有明顯關聯(lián)，rs290481位點AG/GG基因型攜帶者患T2DM合并CHD的風險是AA基因型攜帶者的4.291倍，是T2DM合并CHD的獨立危險因素(OR=4.291)。

目前認為rs290481多態(tài)性可能影響胰島β細胞功能，從而引起血糖升高[4]。有研究表明健康對照組rs290481位點GG基因型攜帶者空腹血糖水平顯著高于AA基因型攜帶者[11]。為了進一步了解rs290481多態(tài)性是否通過影響血糖水平進而增加T2DM合并CHD的易感性，本研究進一步分析各組內rs290481基因型與血糖的相關性，結果發(fā)現(xiàn)在4個研究組內rs290481 基因型與血糖、血脂等各項生化指標均不存在相關性。但將所有研究組作為觀察對象后，發(fā)現(xiàn)AA基因型GLU和HbAlc水平均高于AG+GG基因型，原因可能是由于納入糖尿病患者導致的差異，rs290481基因型是否與糖類代謝有關有待于進一步擴大樣本進行分析。

T2DM合并CHD是糖尿病全身大血管病變的一種表現(xiàn)，為了解T2DM合并CHD的危險因素，本研究Logistic回歸分析顯示,高血壓病史、HbAlc和GlU是T2DM合并CHD的獨立危險因素，HDL-C是預防T2DM合并CHD的保護因素。TCF7L2基因rs290481位點AG/GG基因型增加冠心病、T2DM合并CHD患病的風險。

綜上所述，本研究提示TCF7L2 rs290481基因位點AG/GG基因型是T2DM合并CHD發(fā)生的獨立危險因素，可為2型糖尿病合并冠心病的高危人群提供預警，為疾病的診療提供實驗室依據(jù)。但由于本研究納入的標本量較少，結果存在一定的局限性，有待于進一步擴大樣本量進行更全面的分析。