駱時(shí)木， 歐陽(yáng)航， 蔣燕成， 張志珊

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 福建 泉州 362000)

心血管疾病尤其是冠心病(coronary heart disease, CHD)的發(fā)病率在糖尿病(diabetes mellitus, DM)人群中明顯增高，它是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)最為常見(jiàn)的并發(fā)癥，同時(shí)也是糖尿病患者的常見(jiàn)死亡原因。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，糖尿病患者由于冠心病所引發(fā)的病死率比非糖尿病患者高2～4倍[1]。但目前有關(guān)2型糖尿病增加冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制尚未完全闡明。研究表明，T2DM合并CHD有明顯家族及種族會(huì)集性，其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)中遺傳因素起著重要的作用，許多與T2DM患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的基因位點(diǎn)同時(shí)與冠心病的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[2]。

在眾多易感基因中，TCF7L2是目前發(fā)現(xiàn)的與2型糖尿病相關(guān)性最強(qiáng)的基因[3-7]，但其與T2DM合并CHD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性國(guó)內(nèi)研究較少。在TCF7L2基因眾多SNP位點(diǎn)中，rs7903146、rs12255372、rs290487、rs11196205、rs290481被認(rèn)為與T2DM易感性有關(guān)。TCF7L2 rs290481基因多態(tài)性可能影響胰島β細(xì)胞胰島素分泌功能，從而引起血糖升高[4]，被認(rèn)為與T2DM發(fā)生相關(guān)，但目前尚無(wú)rs290481多態(tài)性與T2DM合并CHD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性報(bào)道。本文探討TCF7L2基因rs290481位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNPs)與2型糖尿病合并冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，以期為2型糖尿病易患冠心病的高危人群提供預(yù)警，為臨床動(dòng)脈粥樣硬化性心血管病的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象：選取2017年12月到2018年6月福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院臨床患者和健康體檢人群作為研究對(duì)象，共480例，且已排除家系(血緣)關(guān)系。對(duì)照組120例均經(jīng)有關(guān)檢查排除冠心病，同時(shí)無(wú)高血壓、糖尿病等病史。T2DM組120例為內(nèi)分泌科就診并診斷為2型糖尿病的患者，其診斷初期口服降糖藥物治療有效，全部患者采用飲食或藥物控制血糖，未使用胰島素治療，無(wú)CHD病史及其他并發(fā)癥。CHD組為選擇同期在心內(nèi)科因CHD住院的患者120例，具有符合冠脈造影檢查證實(shí)冠脈狹窄≥50%者，或者既往有明確心肌梗死病史者，無(wú)DM病史及其他并發(fā)癥。T2DM+CHD組120例為同期心內(nèi)科因冠心病住院的2型糖尿病患者，冠心病和2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)同上。

本研究得到了醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(泉-倫[2017]147號(hào))，所有受試者均在實(shí)驗(yàn)前了解本實(shí)驗(yàn)的目的并簽署知情同意書。

1.1.2 試劑：生化測(cè)定試劑盒(貝克曼公司)；HbAlc檢測(cè)試劑盒(日本愛(ài)科來(lái)公司)；全血DNA提取試劑盒 (Qiagen公司)；引物合成和Taq聚合酶[TaKaRa寶生物工程(北京)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的收集和保存：禁食12～14 h后，于次日清晨采靜脈血2管。其中1管不抗凝血3 mL，分離血清后用于生化指標(biāo)檢測(cè)；而另1管EDTA-K3抗凝血3 mL，其中1 mL用于糖化血紅蛋白測(cè)定(HbAlc)，剩余標(biāo)本用于提取基因組DNA。

1.2.2 生化指標(biāo)檢測(cè)：高效液相色譜法檢測(cè)HbAlc。全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、ApoA和ApoB。葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖，酶法測(cè)定TC、TG、HDL-C和LDL-C，免疫法測(cè)定ApoA和ApoB。實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行操作檢驗(yàn)，用高低兩個(gè)水平配套質(zhì)控品進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.2.3 基因多態(tài)性的檢測(cè)：QIAGEN試劑提取外周血DNA，超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)其DNA濃度及純度。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上下載目標(biāo)SNP位點(diǎn)上下500 bp的基因序列，用引物設(shè)計(jì)軟件primer premier5.0設(shè)計(jì)下列引物：TCF7L2-rs290481(409 bp)：上游引物:5′-CAGTGACATTGTCTGACAGTGG-3′(22 bp)，下游引物:5′-ACTAATTTTGCCCTGCACCAA-3′(21 bp)。引物由TaKaRa合成。PCR反應(yīng)總體積30 μL，包括10×緩沖液3 μL，dNTP 2.4 μL，正向引物和反向引物各0.6 μL，模板DNA 1.5 μL，Taq酶0.15 μL及ddH2O 21.75 μL。PCR循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，57.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行35次循環(huán)；最后延伸72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠電泳，EB(溴化乙錠)染色，凝膠成像儀觀察結(jié)果，以DL500 DNA marker作為參照。擴(kuò)增產(chǎn)物由北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，Chromas軟件分析測(cè)序結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

4組研究對(duì)象的一般臨床資料比較(表1)。與正常對(duì)照組相比較，T2DM組、CHD組、T2DM+CHD組BMI、收縮壓、舒張壓和HbAlc水平均高于對(duì)照組，而 HDL-C、ApoA和ApoB水平低于對(duì)照組(P<0.05)， T2DM組GLU、TC、TG和LDL-C高于對(duì)照組(P<0.05)，T2DM+CHD組GLU、TG高于對(duì)照組(P<0.05)。

與T2DM組比較，CHD組、T2DM+CHD組收縮壓、HbAlc低于T2DM組，T2DM+CHD組BMI、TC、HDL-C、LDL-C和ApoA低于T2DM組(P<0.05)。

與CHD組比較，T2DM+CHD組的收縮壓、HbAlc、GLU和TG大于CHD組，HDL-C、ApoA水平低于CHD組(P<0.05)。

2.2 4組研究對(duì)象TCF7L2 rs290481基因多態(tài)性基因型頻率的分布

TCF7L2 rs290481基因多態(tài)位點(diǎn)在對(duì)照組(χ2=0.700)、T2DM組(χ2=4.247)、CHD組(χ2=3.333)及T2DM+CHD組(χ2=1.864)基因型頻數(shù)分布均符合 Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，所研究的基因型頻數(shù)和預(yù)期的基因型頻數(shù)相符合，具有群體代表性。

對(duì)照組與T2DM組、對(duì)照組與CHD組、T2DM組與CHD組、T2DM組與T2DM+CHD組、CHD組與T2DM+CHD組的基因型分布頻率均存在顯著性差異(P<0.05)(表2)。

2.3 TCF7L2 rs290481各基因型之間生化水平比較

TCF7L2 rs290481基因位點(diǎn)AA基因型HbAlc、GLU水平高于AG+GG基因型(P<0.05)。各組內(nèi)TCF7L2 rs290481 基因型與各生化指標(biāo)沒(méi)有相關(guān)性(表3)。

2.4 T2DM合并CHD危險(xiǎn)因素的二分類Logistic回歸分析

將全部研究對(duì)象作為整體進(jìn)行二分類Logistic回歸分析。二分類劃分標(biāo)準(zhǔn)如下：性別(女性為0，男性為1)；年齡(<60歲為0，≥60歲為1)； 高血壓病史(無(wú)為0，有為1)；BMI(<24 kg/m2為0，≥24 kg/m2為1)；rs290481基因型(AA為0，AG+GG為1)等作為自變量(X)；血脂按照《中國(guó)成人血脂異常防治指南》，將血脂分層切點(diǎn)分為不同的等級(jí)：TC(<5.18 mmol/L為0，≥5.18 mmol/L為1)；TG(<1.70 mmol/L為0，≥1.70 mmol/L為1)；HDL-C(≥1.04 mmol/L為0，<1.04 mmol/L為1)；LDL-C(<3.37 mmol/L為0，≥3.37 mmol/L為1)；GLU(<6.11 mmol/L為0，≥6.11 mmol/L為1)；HbAlc(<6.0%/L為0，≥6.0%為1)分別將是否有2型糖尿病(否為0，有為1),是否有冠心病(否為0，有為1)和是否有T2MD合并CHD(否為0，有為1)作為因變量(Y)，其他指標(biāo)作為自變量(X)。分別校正年齡、性別等相關(guān)因素后，分析結(jié)果顯示：高血壓病史(OR=4.136)、HbAlc(OR=697.561)、Glu(OR=85.555)是本研究對(duì)象中發(fā)生2型糖尿病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；BMI(OR=1.929)、高血壓病史(OR=3.537)是發(fā)生冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；高血壓病史(OR=2.121)、HbAlc(OR=22.606)、GlU(OR=9.023)是發(fā)生T2DM合并CHD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，HDL-C是預(yù)防冠心病(OR=4.049)和T2DM合并CHD(OR=2.764)的保護(hù)因素；rs290481基因型是發(fā)生冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=3.303)，同時(shí)也是發(fā)生T2DM合并CHD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=4.291)。

表1 4組研究對(duì)象一般臨床資料比較Table 1 Comparison of general clinical data in four

表2 4組研究對(duì)象組TCF7L2 rs290481基因型及等位基因頻率分布的比較Table 2 Comparison of genotype and allele frequency distribution of TCF7L2 rs290481 in four groups

表3 所有研究對(duì)象TCF7L2 rs290481各基因型間生化項(xiàng)目比較Table 3 Comparison of biochemical items between genotype AA and AG/GG of rs290481 in all research objects

3 討論

TCF7L2編碼產(chǎn)物是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，Wnt信號(hào)通路通過(guò)促進(jìn)腸道內(nèi)分泌L細(xì)胞分泌胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)，在調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用[8]。TCF7L2多態(tài)性可能通過(guò)間接減少腸內(nèi)分泌細(xì)胞GLP-1的分泌，增加2型糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)[9]。

TCF7L2 rs290481基因多態(tài)性與T2DM的相關(guān)性國(guó)內(nèi)報(bào)道并不一致。本研究rs290481位點(diǎn)共檢測(cè)到177個(gè)AG雜合型突變、106個(gè)GG純合型突變，突變率為58.9%，與福州地區(qū)結(jié)果相近[10]。T2DM組rs290481 AA、AG、GG基因型分布頻率與正常組、CHD組和T2DM+CHD組比較均有顯著性差異，但不是T2DM的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與國(guó)內(nèi)的報(bào)道并不完全一致[11-13]。這可能與地域差異有關(guān)。另一方面，本研究結(jié)果顯示rs290481位點(diǎn)與CHD、T2DM合并CHD有明顯關(guān)聯(lián)，rs290481位點(diǎn)AG/GG基因型攜帶者患T2DM合并CHD的風(fēng)險(xiǎn)是AA基因型攜帶者的4.291倍，是T2DM合并CHD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=4.291)。

目前認(rèn)為rs290481多態(tài)性可能影響胰島β細(xì)胞功能，從而引起血糖升高[4]。有研究表明健康對(duì)照組rs290481位點(diǎn)GG基因型攜帶者空腹血糖水平顯著高于AA基因型攜帶者[11]。為了進(jìn)一步了解rs290481多態(tài)性是否通過(guò)影響血糖水平進(jìn)而增加T2DM合并CHD的易感性，本研究進(jìn)一步分析各組內(nèi)rs290481基因型與血糖的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4個(gè)研究組內(nèi)rs290481 基因型與血糖、血脂等各項(xiàng)生化指標(biāo)均不存在相關(guān)性。但將所有研究組作為觀察對(duì)象后，發(fā)現(xiàn)AA基因型GLU和HbAlc水平均高于AG+GG基因型，原因可能是由于納入糖尿病患者導(dǎo)致的差異，rs290481基因型是否與糖類代謝有關(guān)有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行分析。

T2DM合并CHD是糖尿病全身大血管病變的一種表現(xiàn)，為了解T2DM合并CHD的危險(xiǎn)因素，本研究Logistic回歸分析顯示,高血壓病史、HbAlc和GlU是T2DM合并CHD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，HDL-C是預(yù)防T2DM合并CHD的保護(hù)因素。TCF7L2基因rs290481位點(diǎn)AG/GG基因型增加冠心病、T2DM合并CHD患病的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，本研究提示TCF7L2 rs290481基因位點(diǎn)AG/GG基因型是T2DM合并CHD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可為2型糖尿病合并冠心病的高危人群提供預(yù)警，為疾病的診療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。但由于本研究納入的標(biāo)本量較少，結(jié)果存在一定的局限性，有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行更全面的分析。