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        Rev-erb激動劑SR9009通過降低自噬抑制人結(jié)腸癌細胞系HCT116增殖

        2020-12-28 00:54:44侯曉鴻王曉暉
        基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床 2020年11期
        關(guān)鍵詞:生物鐘孔板激動劑

        石 光,寧 娜,侯曉鴻,孫 聰,原 媛,王 麗,王曉暉*

        (山西醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院 1.病理教研室; 2.形態(tài)學實驗室, 山西 太原 030001)

        結(jié)腸癌(colon cancer)是世界范圍內(nèi)的高發(fā)惡性腫瘤之一,2018年全球癌數(shù)據(jù)[1]報道新增結(jié)直腸癌約180萬例,病死率接近50%。研究表明,結(jié)腸癌病死率高的原因之一是癌細胞的保護性自噬[2],即癌細胞快速增殖消耗大量營養(yǎng),導致部分癌細胞處于營養(yǎng)缺乏的微環(huán)境,這些癌細胞通過自噬途徑吞噬破碎的細胞器回收營養(yǎng),以維持其快速增殖。如果能有效地抑制這種自噬,則可限制結(jié)腸癌細胞的增殖活性。但是,目前臨床抑制細胞自噬的手段有限,需要尋找安全有效的方案。有文獻報道,包括自噬在內(nèi)的代謝活動受到人體自身生物鐘的調(diào)控[3]。多種生物鐘基因中,調(diào)控代謝晝夜節(jié)律的血紅素調(diào)節(jié)核受體(hemeregulated nuclear receptor,Rev-erb)包括Rev-erb α和Rev-erb β的基因與癌細胞自噬密切相關(guān)[4]。因此,從Rev-erb入手抑制腫瘤細胞自噬可能是一種有潛力的結(jié)腸癌治療策略。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 細胞:人源結(jié)腸癌細胞系HCT116(山西醫(yī)科大學生理學系保存)。

        1.1.2 主要試劑:SR9009(MCE公司);生物鐘調(diào)節(jié)蛋白Rev-erb抗體(Affinity Biosciences公司);自噬蛋白Beclin1、LC3、p62抗體(Abcam公司);DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);青鏈霉素(Solarbio公司);CCK-8試劑盒[東仁化學科技(上海)有限公司];Real-time PCR引物(TaKaRa公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 細胞的培養(yǎng)與處理:將結(jié)腸癌細胞HCT116復蘇后接種到直徑6 cm培養(yǎng)皿中,加入3 mL DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清,1%青鏈霉素),在細胞培養(yǎng)箱(37 ℃ 5% CO2)中增殖24~48 h,鏡下觀察細胞貼壁80%左右,即用胰蛋白酶消化收集細胞懸液(約107個/mL);將細胞懸液均勻接種到6孔板中,上排3孔為對照(control) 組,下排3孔為SR9009組,培養(yǎng)24 h細胞貼壁后,向SR9009組加入適當體積SR9009使其終濃度為20 μmol/L,對照組加入相同體積PBS緩沖液作為溶劑對照,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,進行后續(xù)檢測。

        1.2.2 Real-time PCR檢測Rev-erb, Beclin1, LC3和p62的mRNA轉(zhuǎn)錄:6孔板培養(yǎng)細胞,每孔加入1 mL RNAiso plus裂解液,氯仿抽提總RNA,測吸光度值A(chǔ)260換算濃度,用PrimeScript kit 反轉(zhuǎn)錄為20 μL cDNA;取2 μL cDNA作為擴增模板加入96孔板,添加待測基因或內(nèi)參RPLP0(一種核糖體管家基因)的上下游引物(表1)各1 μL,TB Green PremixEx TaqⅡ 12.5 μL,蒸餾水8.5 μL;反應(yīng)體系:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,40個循環(huán);55 ℃ 30 s;得Ct值,計算2-△△Ct,比較各組基因轉(zhuǎn)錄情況。

        表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequences

        1.2.3 Western blot檢測Rev-erb, Beclin1, LC3和p62的蛋白表達:6孔板培養(yǎng)細胞,每孔加入1 mL RIPA裂解液(強),冰上裂解30 min,刮下收集到1.5 mL離心管中,4 ℃ 10 000 r/min離心取上清即為蛋白樣品,BCA試劑盒測蛋白濃度,兌上樣緩沖液煮沸10 min;配制SDS-PAGE凝膠,上樣電泳,80 V 40 min,進入分離膠后120 V 120 min,半干法15 V 15 min轉(zhuǎn)PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,TBST緩沖液漂洗,4℃孵育一抗12 h,室溫孵育二抗1 h,滴加100 μL ECL發(fā)光液曝光;ImageJ軟件分析圖片條帶灰度值,判斷蛋白表達量。

        1.2.4 CCK-8法檢測細胞活性:將細胞懸液均勻接種到96孔板中,每孔100 μL,37 ℃培養(yǎng)24 h后細胞貼壁,將細胞分為4組:對照組、SR9009組、3-MA(3-methyladenine)組、rapamycin組。對照組加PBS;SR9009組用20 μmol/L SR9009處理24 h;3-MA組用20 μmol/L SR9009預處理12 h,再用5 mmol/L自噬抑制劑3-MA處理12 h;rapamycin組用20 μmol/L SR9009預處理12 h,再用100 μmol/L自噬激動劑 rapamycin處理12 h。各組處理結(jié)束后,每孔加10 μL CCK-8試劑,37 ℃保溫2 h,酶標儀測450 nm吸光度值,吸光度值與細胞活性成正比。

        1.3 統(tǒng)計學分析

        2 結(jié)果

        2.1 SR9009抑制HCT116細胞增殖

        與對照組相比,SR9009處理組細胞之間空隙變大,細胞不堆疊增殖,細胞增殖能力降低(圖1)。20 μmol/L SR9009即對細胞活性有顯著抑制(P<0.05);20 μmol/L SR9009處理細胞24 h后細胞活性已有明顯下降(P<0.05)(圖2)。

        2.2 SR9009促進HCT116細胞Rev-erb α和Rev-erb β的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達

        SR9009處理組HCT116細胞的Rev-erb α和Rev-erb β轉(zhuǎn)錄水平都顯著高于對照組(P<0.01)(圖3A, D),SR9009組HCT116細胞的Rev-erb α和Rev-erb β蛋白的表達都顯著升高(P<0.05)(圖3B,C, E,F)。

        圖1 Rev-erb激動劑SR9009抑制HCT116 細胞的增殖Fig 1 Rev-erb agonist SR9009 inhibited HCT116 cell proliferation (20 μmol/L 72 hours)

        2.3 SR9009降低HCT116細胞自噬

        SR9009處理組HCT116細胞的自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降(P<0.05),但p62轉(zhuǎn)錄改變不顯著(圖4);SR9009處理組細胞自噬蛋白Beclin1和LC3Ⅱ表達顯著下降(P<0.05),p62蛋白含量升高(圖5)。

        2.4 SR9009通過降低自噬抑制HCT116細胞活性

        SR9009組細胞活性比對照組降低,3-MA組細胞活性比SR9009組下降(P<0.05),rapamycin組細胞活性比SR9009組顯著上升(P<0.05)(圖6)。

        3 討論

        結(jié)腸癌是一種高致死率的惡性腫瘤[1]。研究發(fā)現(xiàn),在結(jié)腸癌化療中,癌細胞的自噬有抵抗凋亡,維持增殖的作用[5]。如果能有效降低自噬,則可限制結(jié)腸癌細胞的不斷進展。細胞自噬具有節(jié)律振蕩的特點[6]。因此,可以通過晝夜節(jié)律這個天然調(diào)節(jié)器來抑制自噬。

        A.SR9009 treatment doses; B.SR9009 treatment times; *P<0.05 compared with control group圖2 SR9009抑制HCT116細胞的活性Fig 2 SR9009 treatment decreased HCT116 cell n=12)

        A.relative Rev-erb α transcription; B.relative Rev-erb α expression; C.quantification of B; D.relative Rev-erb β transcription; E relative Rev-erb β expression; F.quantification of E; *P<0.05, **P<0.01 compared with control group

        A.relative Beclin1 transcription; B.relative LC3 transcription; C.relative p62 transcription; *P<0.05, **P<0.01 compared with control group

        晝夜節(jié)律的分子機制是由多個生物鐘基因組成的轉(zhuǎn)錄翻譯反饋環(huán)路[7],其中Rev-erb(包含Rev-erb α和Rev-erb β)是一種重要的負調(diào)節(jié)基因,可以抑制代謝相關(guān)基因表達,Rev-erb一般在白天表達較低,而夜晚水平升高[8],以維持代謝活動的晝夜節(jié)律。

        A.relative Beclin1 expression; B.relative LC3 expression; C.relative p62 expression; *P<0.05 compared with control group

        *P<0.05 compared with SR9009 group圖6 3-MA促進SR9009對HCT116細胞活性的抑制, rapamycin逆轉(zhuǎn)SR9009對HCT116細胞活性的抑制Fig 6 Autophagy inhibitor 3-MA decreased HCT116 cell viability that suppressed by SR9009, meanwhile autophagy activator rapamycin increased the

        SR9009是一種人工合成的Rev-erb小分子激動劑[9]。本研究使用SR9009處理體外培養(yǎng)的HCT116結(jié)腸癌細胞,發(fā)現(xiàn)HCT116細胞的Rev-erb表達相比對照組顯著升高,表明SR9009可以在結(jié)腸癌細胞中激活Rev-erb。有文獻報道,這類調(diào)節(jié)Rev-erb活性的小分子化合物是一種有潛力的新型抗癌藥物[10],激活Rev-erb可以抑制多種癌細胞的增殖,如乳腺癌[11]、膠質(zhì)母細胞瘤[12]等。本研究用Rev-erb激動劑SR9009以不同劑量和處理時間干預HCT116培養(yǎng),結(jié)果表明SR9009以劑量依賴和時間依賴的方式,有效持續(xù)地抑制結(jié)腸癌細胞的增殖活性,但其具體機制還不清楚。

        Rev-erb除了調(diào)節(jié)代謝節(jié)律以外,也是一種自噬調(diào)節(jié)因子[13]。自噬通過溶酶體降解回收細胞內(nèi)的物質(zhì),是一種重要的分解代謝活動。研究表明,在多種乳腺癌細胞系中,激活Rev-erb可以抑制細胞自噬[14]。本研究發(fā)現(xiàn),用SR9009處理HCT116結(jié)腸癌細胞后,自噬啟動蛋白Beclin1表達下降,自噬融合蛋白LC3表達減少,自噬降解蛋白p62積累增多,這表明SR9009使結(jié)腸癌細胞的自噬受到抑制。有研究報道,自噬抑制劑3-MA提升了人結(jié)腸癌細胞系HT-29對硫化舒林酸(一種非甾抗炎藥)誘導其凋亡的敏感性[15]。本研究在SR9009預處理HCT116細胞基礎(chǔ)上,用3-MA抑制自噬,細胞活性進一步降低;用rapamycin激活自噬,細胞活性顯著回升,這表明SR9009抑制HCT116細胞增殖活性的機制確實是降低自噬。

        綜上所述,用SR9009激活生物鐘調(diào)節(jié)基因Rev-erb,可以通過降低細胞自噬達到抑制結(jié)腸癌細胞增殖活性的目的。這為探索結(jié)腸癌治療的時間生物學方案提供了理論基礎(chǔ)。

        志謝:感謝山西醫(yī)科大學生理學系崔香麗教授、吳亞俐同學贈送HCT116細胞。

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