石 光，寧 娜，侯曉鴻，孫 聰，原 媛，王 麗，王曉暉*

(山西醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1.病理教研室； 2.形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 山西 太原 030001)

結(jié)腸癌(colon cancer)是世界范圍內(nèi)的高發(fā)惡性腫瘤之一，2018年全球癌數(shù)據(jù)[1]報(bào)道新增結(jié)直腸癌約180萬例，病死率接近50%。研究表明，結(jié)腸癌病死率高的原因之一是癌細(xì)胞的保護(hù)性自噬[2]，即癌細(xì)胞快速增殖消耗大量營養(yǎng)，導(dǎo)致部分癌細(xì)胞處于營養(yǎng)缺乏的微環(huán)境，這些癌細(xì)胞通過自噬途徑吞噬破碎的細(xì)胞器回收營養(yǎng)，以維持其快速增殖。如果能有效地抑制這種自噬，則可限制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖活性。但是，目前臨床抑制細(xì)胞自噬的手段有限，需要尋找安全有效的方案。有文獻(xiàn)報(bào)道，包括自噬在內(nèi)的代謝活動(dòng)受到人體自身生物鐘的調(diào)控[3]。多種生物鐘基因中，調(diào)控代謝晝夜節(jié)律的血紅素調(diào)節(jié)核受體(hemeregulated nuclear receptor，Rev-erb)包括Rev-erb α和Rev-erb β的基因與癌細(xì)胞自噬密切相關(guān)[4]。因此，從Rev-erb入手抑制腫瘤細(xì)胞自噬可能是一種有潛力的結(jié)腸癌治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人源結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116(山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系保存)。

1.1.2 主要試劑：SR9009(MCE公司)；生物鐘調(diào)節(jié)蛋白Rev-erb抗體(Affinity Biosciences公司)；自噬蛋白Beclin1、LC3、p62抗體(Abcam公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；青鏈霉素(Solarbio公司)；CCK-8試劑盒[東仁化學(xué)科技(上海)有限公司]；Real-time PCR引物(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與處理：將結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116復(fù)蘇后接種到直徑6 cm培養(yǎng)皿中，加入3 mL DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，1%青鏈霉素)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃ 5% CO2)中增殖24～48 h，鏡下觀察細(xì)胞貼壁80%左右，即用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞懸液(約107個(gè)/mL)；將細(xì)胞懸液均勻接種到6孔板中，上排3孔為對照(control) 組，下排3孔為SR9009組，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，向SR9009組加入適當(dāng)體積SR9009使其終濃度為20 μmol/L，對照組加入相同體積PBS緩沖液作為溶劑對照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.2.2 Real-time PCR檢測Rev-erb, Beclin1, LC3和p62的mRNA轉(zhuǎn)錄：6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，每孔加入1 mL RNAiso plus裂解液，氯仿抽提總RNA，測吸光度值A(chǔ)260換算濃度，用PrimeScript kit 反轉(zhuǎn)錄為20 μL cDNA；取2 μL cDNA作為擴(kuò)增模板加入96孔板，添加待測基因或內(nèi)參RPLP0(一種核糖體管家基因)的上下游引物(表1)各1 μL，TB Green PremixEx TaqⅡ 12.5 μL，蒸餾水8.5 μL；反應(yīng)體系：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；55 ℃ 30 s；得Ct值，計(jì)算2-△△Ct，比較各組基因轉(zhuǎn)錄情況。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequences

1.2.3 Western blot檢測Rev-erb, Beclin1, LC3和p62的蛋白表達(dá)：6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，每孔加入1 mL RIPA裂解液(強(qiáng))，冰上裂解30 min，刮下收集到1.5 mL離心管中，4 ℃ 10 000 r/min離心取上清即為蛋白樣品，BCA試劑盒測蛋白濃度，兌上樣緩沖液煮沸10 min；配制SDS-PAGE凝膠，上樣電泳，80 V 40 min，進(jìn)入分離膠后120 V 120 min，半干法15 V 15 min轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST緩沖液漂洗，4℃孵育一抗12 h，室溫孵育二抗1 h，滴加100 μL ECL發(fā)光液曝光；ImageJ軟件分析圖片條帶灰度值，判斷蛋白表達(dá)量。

1.2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞活性：將細(xì)胞懸液均勻接種到96孔板中，每孔100 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h后細(xì)胞貼壁，將細(xì)胞分為4組：對照組、SR9009組、3-MA(3-methyladenine)組、rapamycin組。對照組加PBS；SR9009組用20 μmol/L SR9009處理24 h；3-MA組用20 μmol/L SR9009預(yù)處理12 h，再用5 mmol/L自噬抑制劑3-MA處理12 h；rapamycin組用20 μmol/L SR9009預(yù)處理12 h，再用100 μmol/L自噬激動(dòng)劑 rapamycin處理12 h。各組處理結(jié)束后，每孔加10 μL CCK-8試劑，37 ℃保溫2 h，酶標(biāo)儀測450 nm吸光度值，吸光度值與細(xì)胞活性成正比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SR9009抑制HCT116細(xì)胞增殖

與對照組相比，SR9009處理組細(xì)胞之間空隙變大，細(xì)胞不堆疊增殖，細(xì)胞增殖能力降低(圖1)。20 μmol/L SR9009即對細(xì)胞活性有顯著抑制(P<0.05)；20 μmol/L SR9009處理細(xì)胞24 h后細(xì)胞活性已有明顯下降(P<0.05)(圖2)。

2.2 SR9009促進(jìn)HCT116細(xì)胞Rev-erb α和Rev-erb β的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)

SR9009處理組HCT116細(xì)胞的Rev-erb α和Rev-erb β轉(zhuǎn)錄水平都顯著高于對照組(P<0.01)(圖3A, D)，SR9009組HCT116細(xì)胞的Rev-erb α和Rev-erb β蛋白的表達(dá)都顯著升高(P<0.05)(圖3B,C, E,F)。

圖1 Rev-erb激動(dòng)劑SR9009抑制HCT116 細(xì)胞的增殖Fig 1 Rev-erb agonist SR9009 inhibited HCT116 cell proliferation (20 μmol/L 72 hours)

2.3 SR9009降低HCT116細(xì)胞自噬

SR9009處理組HCT116細(xì)胞的自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降(P<0.05)，但p62轉(zhuǎn)錄改變不顯著(圖4)；SR9009處理組細(xì)胞自噬蛋白Beclin1和LC3Ⅱ表達(dá)顯著下降(P<0.05)，p62蛋白含量升高(圖5)。

2.4 SR9009通過降低自噬抑制HCT116細(xì)胞活性

SR9009組細(xì)胞活性比對照組降低，3-MA組細(xì)胞活性比SR9009組下降(P<0.05)，rapamycin組細(xì)胞活性比SR9009組顯著上升(P<0.05)(圖6)。

3 討論

結(jié)腸癌是一種高致死率的惡性腫瘤[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌化療中，癌細(xì)胞的自噬有抵抗凋亡，維持增殖的作用[5]。如果能有效降低自噬，則可限制結(jié)腸癌細(xì)胞的不斷進(jìn)展。細(xì)胞自噬具有節(jié)律振蕩的特點(diǎn)[6]。因此，可以通過晝夜節(jié)律這個(gè)天然調(diào)節(jié)器來抑制自噬。

A.SR9009 treatment doses; B.SR9009 treatment times; *P<0.05 compared with control group圖2 SR9009抑制HCT116細(xì)胞的活性Fig 2 SR9009 treatment decreased HCT116 cell n=12)

A.relative Rev-erb α transcription; B.relative Rev-erb α expression; C.quantification of B; D.relative Rev-erb β transcription; E relative Rev-erb β expression; F.quantification of E; *P<0.05, **P<0.01 compared with control group

A.relative Beclin1 transcription; B.relative LC3 transcription; C.relative p62 transcription; *P<0.05, **P<0.01 compared with control group

晝夜節(jié)律的分子機(jī)制是由多個(gè)生物鐘基因組成的轉(zhuǎn)錄翻譯反饋環(huán)路[7]，其中Rev-erb(包含Rev-erb α和Rev-erb β)是一種重要的負(fù)調(diào)節(jié)基因，可以抑制代謝相關(guān)基因表達(dá)，Rev-erb一般在白天表達(dá)較低，而夜晚水平升高[8]，以維持代謝活動(dòng)的晝夜節(jié)律。

A.relative Beclin1 expression; B.relative LC3 expression; C.relative p62 expression; *P<0.05 compared with control group

*P<0.05 compared with SR9009 group圖6 3-MA促進(jìn)SR9009對HCT116細(xì)胞活性的抑制， rapamycin逆轉(zhuǎn)SR9009對HCT116細(xì)胞活性的抑制Fig 6 Autophagy inhibitor 3-MA decreased HCT116 cell viability that suppressed by SR9009, meanwhile autophagy activator rapamycin increased the

SR9009是一種人工合成的Rev-erb小分子激動(dòng)劑[9]。本研究使用SR9009處理體外培養(yǎng)的HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HCT116細(xì)胞的Rev-erb表達(dá)相比對照組顯著升高，表明SR9009可以在結(jié)腸癌細(xì)胞中激活Rev-erb。有文獻(xiàn)報(bào)道，這類調(diào)節(jié)Rev-erb活性的小分子化合物是一種有潛力的新型抗癌藥物[10]，激活Rev-erb可以抑制多種癌細(xì)胞的增殖，如乳腺癌[11]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[12]等。本研究用Rev-erb激動(dòng)劑SR9009以不同劑量和處理時(shí)間干預(yù)HCT116培養(yǎng)，結(jié)果表明SR9009以劑量依賴和時(shí)間依賴的方式，有效持續(xù)地抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖活性，但其具體機(jī)制還不清楚。

Rev-erb除了調(diào)節(jié)代謝節(jié)律以外，也是一種自噬調(diào)節(jié)因子[13]。自噬通過溶酶體降解回收細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)，是一種重要的分解代謝活動(dòng)。研究表明，在多種乳腺癌細(xì)胞系中，激活Rev-erb可以抑制細(xì)胞自噬[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，用SR9009處理HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞后，自噬啟動(dòng)蛋白Beclin1表達(dá)下降，自噬融合蛋白LC3表達(dá)減少，自噬降解蛋白p62積累增多，這表明SR9009使結(jié)腸癌細(xì)胞的自噬受到抑制。有研究報(bào)道，自噬抑制劑3-MA提升了人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29對硫化舒林酸(一種非甾抗炎藥)誘導(dǎo)其凋亡的敏感性[15]。本研究在SR9009預(yù)處理HCT116細(xì)胞基礎(chǔ)上，用3-MA抑制自噬，細(xì)胞活性進(jìn)一步降低；用rapamycin激活自噬，細(xì)胞活性顯著回升，這表明SR9009抑制HCT116細(xì)胞增殖活性的機(jī)制確實(shí)是降低自噬。

綜上所述，用SR9009激活生物鐘調(diào)節(jié)基因Rev-erb，可以通過降低細(xì)胞自噬達(dá)到抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活性的目的。這為探索結(jié)腸癌治療的時(shí)間生物學(xué)方案提供了理論基礎(chǔ)。

志謝：感謝山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系崔香麗教授、吳亞俐同學(xué)贈(zèng)送HCT116細(xì)胞。