陳國雁，馮曉波

(上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院 消化內(nèi)科， 上海 200137)

胃癌(gastric cancer)是全球第4大常見惡性腫瘤，全世界每年有100多萬新發(fā)病例，約有78.3萬人死亡[1-2]。雖然近年來胃癌的治療和診斷取得了重大的進展，但由于腫瘤易轉(zhuǎn)移，超過70%的患者手術(shù)切除后仍會復(fù)發(fā)，因此早期發(fā)現(xiàn)良好的篩查生物標志物是降低胃癌病死率的最佳途徑[3]。微RNA(microRNA,miRNA) 是一類高度保守的非編碼RNA。miRNA在包括胃癌在內(nèi)的多種惡性疾病中表達異常[4]。同時越來越多的研究表明miRNA可作為惡性腫瘤潛在的預(yù)后生物標志物和治療靶點[5-6]。在眾多miRNAs中，位于染色體13q的 miR-621在乳腺癌和肝癌中作用均被發(fā)現(xiàn)[7-8]。一項研究表明，由于13q缺失導致miR-621下調(diào)，誘周期調(diào)控的關(guān)鍵基因上調(diào)，導致去分化的肝細胞癌不受控制的增殖[9]。同時也有研究表明miR-621可作為乳腺癌預(yù)后標志物[7]。但目前miR-621在胃癌中的研究及其對臨床的意義和生物學功能尚不明確。

本研究通過檢測胃癌組織和胃癌細胞中miR-621的表達，評估m(xù)iR-621對胃癌的預(yù)后價值，同時改變miR-621表達量，觀察其對胃癌細胞惡性表型的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 患者一般資料：收集2008年8月至2013年8月在上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院治療的120例胃癌患者的癌及癌旁組織，所有樣本均通過2名以上病理學專家明確病理診斷，且臨床資料保存完整，無其他惡性腫瘤史，未接受其他手術(shù)治療。按照美國癌聯(lián)合委員會的第8版TNM分期系統(tǒng)(T是腫瘤范圍的大小，N是擴散到附近的淋巴結(jié)，M是轉(zhuǎn)移到遠端)，Ⅰ-Ⅱ期患者共48例，Ⅲ-Ⅳ期患者72例。本研究經(jīng)上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會的批準(滬醫(yī)倫研：2008-057)，在患者知情且同意情況下使用臨床樣本，并對患者進行為期5年手術(shù)后隨訪及記錄患者臨床病理學資料。

1.1.2 細胞及試劑：人胃黏膜細胞系GES-1和人胃癌細胞系MKN-45、N87、HGC-27及AGS(美國模式培養(yǎng)物保藏所ATCC)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、鏈霉素/青霉素雙抗溶液(Gibco公司)；細胞培養(yǎng)板及Transwell小室(Corning公司)； RNA抽提試劑盒miRNA Purification Kit、反轉(zhuǎn)錄試劑盒miRNA cDNA Synthesis Kit及RT-qPCR試劑盒miRNA qPCR Assay Kit(Cwbiotech公司)；Trizol試劑、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)；轉(zhuǎn)染載體miR-621 mimic、miR-621 inhibitor、mimic NC、inhibitor NC(RiboBio公司)；CCK-8細胞活力檢測試劑盒(MedChemExpress公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)與分組處理：均用含10%胎牛血清(FBS)和含1%青/鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。待細胞至對數(shù)增殖期進行細胞轉(zhuǎn)染實驗。轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine 2000，將細胞分為對照組(control)；mimic control 組：轉(zhuǎn)染mimic control；miR-621 mimic 組：轉(zhuǎn)染miR-621過表達試劑miR-621 mimic；inhibitor control組：轉(zhuǎn)染inhibitor control；miR-621 inhibitor組：轉(zhuǎn)染miR-621抑制試劑miR-621 inhibitor。轉(zhuǎn)染6 h后進行換液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測mRNA：用Trizol分別提取癌和癌旁組織及轉(zhuǎn)染后細胞總RNA，并將其反轉(zhuǎn)成cDNA，然后根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明書進行RT-qPCR檢測組織和細胞中miR-621的表達量。RT-qPCR檢測時以U6作為內(nèi)參進行，使用2-ΔΔCt方法對miR-621的相對表達量進行計算。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖：將轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)期的細胞以每孔1 000個/孔細胞接種于96孔板中，每隔24 h進行檢測，檢測前向孔中添加10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中孵育2 h后，檢測490 nm處吸光度值，連續(xù)檢測3 d，評估m(xù)iR-621對胃癌細胞增殖能力的影響。

1.2.4 Transwell小室法檢測細胞遷移和侵襲：在含有基質(zhì)膠的Transwell上室中添加50 μL培養(yǎng)液放置培養(yǎng)箱中水化基膜30 min，取200 μL含3×104個細胞的懸液添加至Transwell的上室，下室添加500 μL含10% FBS的培養(yǎng)基。過夜培養(yǎng)后，將上室細胞及基質(zhì)膠擦拭掉，4%多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，雙蒸水清洗后，顯微鏡下隨機選取5個視野拍照并計數(shù)，檢測細胞侵襲能力變化。遷移能力檢測時，直接在上室中添加細胞即可，其他操作與侵襲相同。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 miR-621 在胃癌組織和細胞中的表達水平

在胃癌組織中miR-621表達水平顯著低于癌旁組織(圖1A)(P<0.01)。此外，miR-621在胃癌細胞系中的表達水平明顯低于正常胃黏膜細胞(圖1B)(P<0.01)。

2.2 miR-621 表達量與癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

miR-621的表達與胃癌患者的臨床TNM分期(P<0.01)、腫瘤分化程度(P<0.05)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)存在顯著相關(guān)性(表1)，并且表現(xiàn)為miR-621表達水平較低時，胃癌患者的腫瘤分化程度較低、TNM分期為 Ⅲ-Ⅳ、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力。

表1 miR-621表達量與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

A.expression of miR-621 in normal tissues and cancer tissues was detected by RT-qPCR；*P<0.05 compared with normal tissues；B.expression level of miR-621 in normal gastric mucosa cells GES-1 and gastric cancer cell lines was detected by RT-qPCR； *P<0.05, **P< 0.01 compared with GES-1 group

2.3 miR-621在癌患者中的預(yù)后作用

對胃癌患者進行為期5年術(shù)后隨訪，患者總體中位生存期為42個月，miR-621低表達患者的中位生存期為36個月。miR-621低表達的患者生存率顯著低于miR-621高表達的患者(log rank testP<0.001)。進一步探討miR-621與其臨床病理學特征對患者生存率的影響，對胃癌患者臨床數(shù)據(jù)進行分析，miR-621是胃癌的獨立預(yù)后因子(表2)(P<0.01)。

表2 胃癌患者總體生存率的多因素Cox回歸分析

2.4 miR-621對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

miR-621模擬物組表達量顯著高于對照組(P<0.001)，而抑制劑組miR-621的表達量顯著低于對照組(P<0.001)。結(jié)果證明胃癌細胞的轉(zhuǎn)染效率較高(圖2A)。miR-621模擬物組的增殖能力顯著低于對照組(P<0.05)，而miR-621抑制組的增殖能力較對照組顯著增高(圖2B)(P<0.05)。 miR-621抑制劑組的遷移和侵襲細胞數(shù)顯著高于對照組(P<0.001)，而miR-621模擬物組的遷移和侵襲細胞數(shù)顯著低于對照組(圖2C,D)(P<0.001)。

3 討論

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，外科手術(shù)是目前唯一根治的方法，隨著手術(shù)、傳統(tǒng)放化療及新輔助治療技術(shù)的不斷提高和改善，早期胃癌5年生存率高達95%。然而，早期診斷率較低，多數(shù)胃癌患者診斷時已處于晚期，錯過最佳手術(shù)時機，而晚期胃癌中因存在轉(zhuǎn)移風險，所以胃癌患者總體預(yù)后較差[10]。因此尋找治療的預(yù)測標志物和潛在治療靶點對胃癌患者是必要的。

既往的研究已證實miRNA可作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤發(fā)生與進展。而最近的研究發(fā)現(xiàn)異常表達的miRNA可以作為腫瘤診斷和預(yù)后標志物。例如miR-503可通過靶向HMGA2抑制WNT信號通路抑制胃癌細胞的增殖和侵襲，是胃癌的預(yù)后標志物[11]。而miR-621已被報道為某些腫瘤抑癌因子參與腫瘤發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后。如miR-621通過抑制FBXO11對p53的依賴性能增強乳腺癌細胞對PTX/CBP化療的敏感性，是乳腺癌治療的預(yù)測標志物和潛在治療靶點[7]。下調(diào)miR-621可通過靶向CAPRIN1促進肝癌細胞的增殖[8]。

本研究檢測患者癌及癌旁組織，發(fā)現(xiàn)miR-621在胃癌的表達量顯著低于癌旁，且癌細胞的表達量也顯著低于胃黏膜細胞。分析臨床病理特征，發(fā)現(xiàn)miR-621表達水平較低的患者，其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力強、腫瘤分化程度低且TNM分期為III-IV。說明miR-621可能是胃癌的潛在抑癌基因。對miR-621的臨床意義進一步探討，生存曲線和Cox回歸分析證明，miR-621低表達的患者5年生存率較差，且是胃癌獨立預(yù)后因子。這與miR-621在乳腺癌和肝癌的研究類似，證明miR-621具有作為胃癌預(yù)后標志物的潛能。

進一步研究miR-621對胃癌細胞生物學功能的影響。通過研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-621表達可顯著促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。研究表明miR-621作為抑癌基因參與胃癌的進展，是潛在的疾病治療靶點，但miR-621在胃癌中的分子機制尚不明確，需進一步探究。

總上所述，本研究證明miR-621在胃癌組織和細胞中的表達顯著下降，并與胃癌的不良預(yù)后相關(guān)。同時抑制miR-621的表達會顯著促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。因此miR-621可以作為胃癌的一個預(yù)后標志物，且上調(diào)miR-621的表達將有望成為胃癌治療的新策略。

A.expression of miR-621 after cell transfection；B. changes in cell proliferation capacity were detected by CCK-8 assay；C.number of cell migration was detected by Transwell assay；D.number of cell invasion was detected by Transwell assay；*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with control group