陳 笑, 聶安琪, 劉 靜, 陸宇晴, 石嘉琪, 陳曉嵐

(南通大學附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科, 江蘇 南通, 226000)

慢性腎臟疾病(CKD)是一個高度流行的公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)迅速增高，其中多數(shù)患者發(fā)展為終末期腎衰竭，主要組織學表現(xiàn)為腎小球硬化和小管間質(zhì)纖維化。CKD成為繼心腦血管疾病、糖尿病外另一個人類重要的致死原因之一[1]。腎臟微血管內(nèi)皮細胞損傷、炎癥反應、間質(zhì)纖維化是發(fā)生CKD的主要原因。為了提高CKD患者的生存質(zhì)量，改善CKD患者預后，應尋找CKD早期診斷的途徑和新型有效的治療方法。外泌體在缺氧、高糖等生化刺激下分泌異常，并以自分泌、旁分泌、遠分泌的方式將其包裹的信號物質(zhì)傳送到靶細胞，參與腎臟生理、腎臟細胞損傷和修復、免疫反應以及間質(zhì)纖維化等病理過程[2]。相關(guān)研究[3]表明，外泌體衍生的微小RNA(miRNA)不僅可作為診斷和預后評估CKD的敏感生物標志物，還可用于CKD的治療。本綜述重點探討不同來源的外泌體miRNA對CKD的作用機制及在治療中的作用，并展望該領域的發(fā)展前景。

1 外泌體和miRNA的概念

近年來，外泌體成為了研究熱點，其最早于1987年由JOHNSTONE RM等[4]在研究綿羊網(wǎng)織紅細胞成熟過程中發(fā)現(xiàn)。外泌體是一種由細胞分泌且具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的球型納米級胞外囊泡，直徑50～100 nm, 表面含有多種跨膜蛋白如CD63、CD9、腫瘤易感基因101(TSG101)等表面特異性蛋白，介導外泌體識別靶細胞。外泌體內(nèi)部存在蛋白質(zhì)、DNA、非編碼RNA[miRNA、長鏈非編碼RNA(lncRNA)、環(huán)狀RNA(circRNA)]和脂質(zhì)等多種“貨物”。外泌體可作為納米載體介導細胞間的信息傳遞，主要有以下4種方式: ① 外泌體作為信號復合物，通過配體-受體介導方式刺激受體細胞; ② 外泌體在細胞間轉(zhuǎn)移受體; ③ 外泌體向受體細胞轉(zhuǎn)移功能蛋白或傳染性顆粒; ④ 外泌體通過膜融合方式向受體細胞傳遞信使RNA(mRNA)、miRNA或轉(zhuǎn)錄因子等物質(zhì)[5]。其中外泌體衍生的miRNA最早由VALADI H等[6]于2007年發(fā)現(xiàn)。miRNA為一類非轉(zhuǎn)錄的RNA，長度約19～22個核苷酸，通過與靶基因mRNA 3′端非編碼區(qū)(UTR)(3′-UTR)結(jié)合，調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄從而抑制其他蛋白mRNA的表達[7]。目前，在外泌體中已發(fā)現(xiàn)2838種miRNA, 且miRNA選擇性富集，通過檢測外泌體中特異miRNA來監(jiān)測疾病進程成為可能。外泌體miRNA在CKD中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，其異常表達與CKD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

2 不同來源外泌體miRNA對CKD發(fā)生發(fā)展的作用

外泌體的來源十分廣泛，由多種細胞分泌，包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、腫瘤細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和間充質(zhì)干細胞等，并且存在于人體內(nèi)多數(shù)體液中如血漿、血清、尿液、腦脊液、唾液、淚液、胸腔液、腹腔積液等。目前對CKD的作用機制相關(guān)的外泌體miRNA主要來源于腎小管上皮細胞(TECs)、間充質(zhì)干細胞(MSCs)、血清、尿液。

2.1 來源TECs的外泌體miRNA

TECs是腎細胞中含量最多的細胞，發(fā)揮多種調(diào)節(jié)功能。TECs是缺氧、蛋白尿、毒素、代謝紊亂和衰老的最初損傷部位。CKD患者體內(nèi)維持低水平的慢性炎性反應，即“微炎癥狀態(tài)”，影響CKD的發(fā)展。巨噬細胞是促進腎臟炎癥和纖維化的關(guān)鍵炎癥細胞，在DKD發(fā)展過程中，巨噬細胞主要表現(xiàn)為M1型，可釋放炎癥因子，促進腎臟纖維化。JIA Y等[8]研究發(fā)現(xiàn)，隨著糖尿病腎病(DN)的發(fā)展，糖尿病小鼠腎組織中M1巨噬細胞相關(guān)標志物增加，人血清白蛋白(HSA)誘導的近曲小管上皮細胞(HK-2)胞外囊泡(EVs)與巨噬細胞誘導的巨噬細胞M1在脂多糖(LPS)存在下極化，并且發(fā)現(xiàn)來自HSA刺激HK-2細胞衍生EV的miR-199a-5p通過靶向Klotho/TLR4途徑誘導M1極化并進一步加速DN的進展。LV LL等[9]對小鼠急性腎損傷(AKI)模型和CKD模型研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，另一種來源TECs的外泌體miR-19b-3p同樣介導受損TECs和巨噬細胞之間的通訊，導致M1巨噬細胞活化，促進炎癥反應發(fā)生。SHAO X等[10]研究發(fā)現(xiàn)miR-30b通過誘導細胞凋亡、釋放炎性細胞因子、削弱自噬過程來促進LPS誘導HK-2細胞發(fā)生炎性損傷。但ZHANG L等[11]研究表明來源TSCs的外泌體miR-20a通過調(diào)控細胞凋亡和炎性細胞因子釋放來抑制LPS誘導HK-2細胞損傷，且進一步發(fā)現(xiàn)miR-20a通過靶向血清趨化因子配體12(CXCL12)來抑制核因子NF-κB和調(diào)控細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)信號通路，進而抑制LPS誘導HK-2細胞損傷。提示來源TECs的外泌體miRNA在調(diào)節(jié)CKD微炎癥狀態(tài)中有重要作用。

2.2 來源MSCs的外泌體miRNA

干細胞使組織具有再生能力并能在大多數(shù)損傷中幸存。MSCs是研究最多的干細胞之一。人MSCs由多種組織分離，包括骨髓和脂肪組織。急性腎損傷(AKI)使患者罹患進行性CKD的風險增加。ZHU F等[12]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Sox9在包括腎臟在內(nèi)的多種組織器官的發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，人類脂肪MSCs采用外泌體通過腎小管上皮細胞依賴性Sox9激活來減少AKI和抑制CKD進展。MSCs衍生的EVs在不同的腎損傷動物模型中均具有促再生潛能。EVs包含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，其中miRNA在EVs的再生潛能中具有重要作用。COLLINO F等[13]觀察到MSCs和EVs中的miRNA缺失可顯著降低AKI患者的內(nèi)在再生潛能，提示miRNA在AKI后的恢復中起著關(guān)鍵作用。TAPPARO M等[14]對經(jīng)MSCs衍生EVs和未經(jīng)處理的AKI小鼠腎臟分子進行了RNA測序分析，測得的miRNA與在MSCs衍生的EVs中表達增加的50個miRNA進行后交叉匹配，鑒定出以下miRNA: miR-10a-5p、miR-127-3p、miR-29a-3p、let-7a和miR-30a-5p、miR-486-5p。為了評估所選miRNA促進小管細胞增殖的潛力，用miRNA模擬物處理小鼠小管上皮細胞，并置于缺氧/復氧條件下，所選miRNA可增殖，用特異性miRNA模擬物電穿孔瞬時轉(zhuǎn)染MSCs, 分析表明，轉(zhuǎn)染后MSCs和衍生的EVs有效富集了所選miRNA。體內(nèi)、體外實驗表明，含有miRNA的EVs能保持其促再生作用。腎小球和腎小管間質(zhì)纖維化是CKD的特征之一。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是纖維化的一個關(guān)鍵過程，單側(cè)輸尿管阻塞(UUO)已被廣泛用作腎纖維化的模型，具有誘導腎纖維化快速發(fā)展的優(yōu)勢，同時還可以模擬間質(zhì)纖維化的細胞進展過程[15]。HE J等[16]研究發(fā)現(xiàn)在UUO小鼠模型中來源MSCs的外泌體的可顯著改善體內(nèi)、體外的治療效果，且優(yōu)于單純MSCs, 保護小鼠免受EMT和腎功能衰竭的侵害。同時也發(fā)現(xiàn)相關(guān)miRNA對腎臟有保護作用，其參與調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號通路和纖維化機制。對于MSCs對腎臟的保護作用，尤其是抑制腎纖維化過程, WANG B等[17]也觀察到MSCs的外泌體可選擇性轉(zhuǎn)移miR-let7c至受損的腎細胞，從而導致腎纖維化減緩。目前，多項研究表明MSCs衍生的EVs具有促再生潛能，來源MSCs的外泌體可以減緩AKI向CKD進展，且相關(guān)miRNA參與腎臟保護，但具體保護機制仍需進一步明確。

2.3 來源血清的miRNA

在血清中尋找外泌體，具有創(chuàng)傷小、簡便快捷、費用低廉等優(yōu)點，且血清miRNA相對穩(wěn)定，不易降解，所以miRNA作為血清標志物的越來越受到關(guān)注。腎臟纖維化幾乎發(fā)生在所有類型的慢性腎臟疾病中。ZHANG A等[18]在UUO小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，血清外泌體攜帶的miR-26a通過抑制結(jié)締組織生長因子(CTGF)來限制腎纖維化。KIM H[19]通過與健康志愿者相比，發(fā)現(xiàn)DN患者的血清外泌體miRNA let-7c-5p明顯上調(diào)。有研究[20-21]表明, miRNA let-7家族成員(let-7b和let-7c)通過調(diào)節(jié)TGF-β信號傳導在DM的腎纖維化中發(fā)揮功能性作用，提示miRNA let-7c-5p水平的上調(diào)可能是一種生理反應，可限制腎臟纖維化的發(fā)生。FAN Q等[22]選取了50例經(jīng)腎活檢證實為IgA腎病的患者和25例健康志愿者，發(fā)現(xiàn)IgA腎病患者的血清和腎內(nèi)miR-192表達低于正常對照組，在其進展過程中也觀察到miR-192水平的下調(diào)，表明IgA腎病患者血清miR-192表達量降低，腎小管萎縮，間質(zhì)性炎癥和纖維化趨勢增加。血清外泌體攜帶的miRNA對腎臟有保護作用，可以限制腎臟纖維化，在CKD的早期診斷和病情進展中，有望成為新的生物標志物。

2.4 來源尿液的miRNA

相比骨髓穿刺、腎穿刺活檢、抽血等有創(chuàng)檢查，從尿液中尋找外泌體miRNA作為非侵入性診斷依據(jù)，不僅對患者的耐受性要求低，同時可提高患者的依從性。CKD的基本病理變化為腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化, WANG B等[23]發(fā)現(xiàn)TGF-β1通過抑制miRNA-29的表達促進腎纖維化。LV LL等[24]選取32例接受腎臟活檢的CKD患者尿液和7例對照組尿液，發(fā)現(xiàn)miR-29c水平隨纖維化程度增加而降低，尿液外泌體中miR-29c的檢測表明其有可轉(zhuǎn)化為臨床生物標志物。LV CY等[25]通過對35例腎纖維化患者和20例非腎纖維化患者尿液miRNAs研究結(jié)論與上述結(jié)果一致, miR-29c水平與腎纖維化程度呈負相關(guān)，且miR-29c與纖維化形成的后期密切相關(guān), miR-21與纖維化形成的早期緊密相關(guān)。相關(guān)研究[26]發(fā)現(xiàn)除了miR-29c水平降低與腎纖維化有關(guān)，具有較高穩(wěn)定性和較高診斷價值外，尿外泌體miR-21水平在超早期纖維化中顯著升高(纖維化程度為0%～5%), 但隨著纖維化程度的增加，尿外泌體中miR-21的水平略有降低(輕度纖維化組)，然后略有升高(中度和重度纖維化組)。尿外泌體miRNA可以作為新型腎纖維化的非侵入型標志物，參與CKD的診斷和判斷預后。

3 外泌體miRNA在CKD治療中的作用

目前對CKD的治療主要集中在減緩疾病進展方面，盡管有良好的效果，但不足以對抗疾病的演變。多數(shù)終末期腎病患者需進行血液透析或腎臟替代治療，后者成本高且器官可獲得性差[27]。因此，尋找新型有效的治療方法成為了現(xiàn)階段的研究關(guān)鍵。LI ZL等[28]研究發(fā)現(xiàn)，腎小管缺氧誘導因子-1通過外泌體介導的TECs和巨噬細胞間的通訊刺激腎間質(zhì)炎癥。腎小管缺氧誘導因子-1a通過外泌體miRNA-23a轉(zhuǎn)移促進巨噬細胞活化，抑制髓細胞A20。此發(fā)現(xiàn)為低氧損傷和腎間質(zhì)炎癥在腎臟中的交叉機制提供了理論依據(jù)，阻斷miRNA-23a信號可為治療腎臟病(缺氧導致)的靶點。YU J等[29]研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-3607-3p和hsa-miR-4709-3p可能為治療腎纖維化的靶點。腎間質(zhì)纖維化的特征是EMT和細胞外基質(zhì)沉積過多，非編碼RNA心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(MIAT)通過調(diào)節(jié)miR-145/EIF5A2軸來增殖細胞，為腎間質(zhì)纖維化建立了潛在的療法[30]。

DN是糖尿病的嚴重并發(fā)癥，也是CKD的主要原因之一。足細胞是腎小球內(nèi)的一種常駐細胞，對于維持腎小球濾過功能起著重要作用[31]。足細胞在糖尿病腎病損傷中，會發(fā)生肥大、EMT、脫離和凋亡等形態(tài)變化[32]。HUANG H[33]等研究證實M2巨噬細胞可以通過分泌外泌體miR-25-3p來改善高糖(HG)誘導的足細胞損傷，抑制(雙特異性磷脂酶1)DUSP1的表達來激活細胞自噬。足細胞遷移參與蛋白尿產(chǎn)生的過程，與DN的發(fā)生相關(guān)。脂肪干細胞的外泌體(ADSCs-Exo)miR-251-5p是ADSCs-Exo介導的足細胞損傷過程中起保護作用的關(guān)鍵因素。抑制miR-251-5p限制了ADSCs-Exo對HG誘導的增殖抑制和遷移促進的改善，且單獨的miR-215-5p模擬物可顯著逆轉(zhuǎn)HG誘導的足細胞EMT過程[34]。巨噬細胞和脂肪干細胞衍生的外泌體，有望作為DN的新型潛在治療靶點。

MCSs具有無限復制潛力，以及體外分化為中胚層組織成熟細胞的能力。這些細胞主要與其抑制炎癥和激活組織再生的能力有關(guān)[35]。EBRAHIM N等[36]調(diào)節(jié)糖尿病小鼠模型中的自噬、纖維化標記物，采用MSCs衍生的外泌體治療，改善腎功能并修復受損腎組織。血管鈣化是CKD患者的常見并發(fā)癥，骨髓MSCs衍生的外泌體可通過修飾miRNA減緩高磷誘導的血管平滑肌細胞鈣化[37]。外源性間充質(zhì)干細胞治療可改善AKI，但探討MSCs治療CKD的潛在優(yōu)勢相關(guān)研究較少，且其用于臨床治療的安全性仍需進一步確認。

4 小結(jié)和展望

外泌體是內(nèi)含蛋白質(zhì)、非編碼RNA、脂質(zhì)等的細胞外囊泡，在相關(guān)疾病的生理與病理過程中發(fā)揮重要作用，且可以多種方式傳遞信息，外泌體中的miRNA可與靶基因結(jié)合調(diào)控基因表達。研究顯示外泌體可作用于CKD的發(fā)生發(fā)展，檢測外泌體miRNA有助于CKD的診斷和治療。不同來源的外泌體miRNA在CKD中發(fā)揮的作用存在差異，與腎小管間質(zhì)纖維化、炎癥程度等有密切聯(lián)系。體內(nèi)體外實驗表明，外泌體miRNA有望成為CKD早期診斷的標志物，但其作用機制尚未明確，仍需對外泌體miRNA進行研究，為治療慢性腎病提供可靠、成熟的理論依據(jù)，以期早期診斷患者并改善預后。