徐海軍，李 丹，王 磊，平東萍，爨淑楠，蔣 平，佘德勇

(1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室)

糖尿病是一種胰島素分泌缺陷(1型糖尿病)或胰島素作用障礙(2型糖尿病)所致的、以高血糖為特征的代謝性疾病。1型糖尿病是一種先天家族遺傳的自體免疫性疾病，其特征是T細(xì)胞介導(dǎo)的分泌胰島素的胰島β-細(xì)胞破壞，導(dǎo)致高血糖，患者需要終生胰島素治療。1型糖尿病多發(fā)于兒童和青少年，治療不當(dāng)或不及時(shí)極易引起并發(fā)癥，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致患者死亡[1]。

糖尿病的治療方法目前主要依靠藥物治療，同時(shí)配合飲食治療和運(yùn)動(dòng)治療。Zhao等[2]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)提供豐富多樣的膳食纖維，可以使人體腸道內(nèi)特定有益菌群升高，進(jìn)而改善2型糖尿病的臨床癥狀。該研究鑒定出來(lái)自3個(gè)門(mén)的15株產(chǎn)丁酸菌與2型糖尿病的改善密切相關(guān)[2]。另有研究表明1型糖尿病患者糞便中產(chǎn)丁酸菌數(shù)量減少[3]。已有大量研究表明日糧中添加丁酸鈉可以改善動(dòng)物的腸道菌群結(jié)構(gòu)[4-6]。因此，本項(xiàng)目研究了在日糧中添加丁酸鈉對(duì)1型糖尿病模型小鼠血糖、血清胰島素水平和腸道菌群的影響，以評(píng)估該方法對(duì)1型糖尿病的治療效果及可能機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種雄性小鼠，體質(zhì)量18～22g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)第01號(hào)。小鼠飼養(yǎng)在23℃有空調(diào)的房?jī)?nèi)，自然光照，自由采食和飲水。

1.2 藥品與試劑

鏈脲佐菌素(上海麥克林生化科技有限公司)；丁酸鈉(純度99%)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；BBL瓊脂培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)；疊氮鈉—結(jié)晶紫—七葉苷瓊脂(北京華威銳科化工有限公司)；胰月示—亞硫酸鹽—環(huán)絲氨酸瓊脂基礎(chǔ)和環(huán)絲氨酸、MRS瓊脂(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；小鼠胰島素ELISA試劑盒(北京安迪華泰科技有限公司)、醫(yī)用血糖測(cè)試紙(三諾生物傳感股份有限公司)。

1.3 主要儀器

三諾血糖測(cè)試儀(三諾生物傳感股份有限公司)；FA1204 B型電子分析天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；JW-3021HR型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司)；立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；DGT-G250型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、SPT-P250C型智能生化培養(yǎng)箱(合肥華德利科學(xué)器材有限公司)；SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；Synergy H1多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)；XK-97A型菌落計(jì)數(shù)器(杭州齊威儀器有限公司)。

1.4 分組與給藥

參照文獻(xiàn)[7]方法，造模前將小鼠禁食12h，然后腹腔注射200mg/kg鏈脲佐菌素[鏈脲佐菌素溶解在預(yù)冷的0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH4.2～4.5)中，配制成2%溶液，經(jīng)0.22μm濾菌器過(guò)濾除菌，避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用，在30min內(nèi)注射完畢]。注射后小鼠自由攝食及飲水，期間觀察造模小鼠的飲水量、攝食量、排尿量等情況。5d后，小鼠尾靜脈采血并使用血糖儀檢測(cè)空腹血糖濃度，血糖濃度大于11.1mmol/dL的小鼠認(rèn)定為糖尿病造模成功。將造模成功的20只小鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組和糖尿病模型+丁酸鈉組，每組10只。另設(shè)同批購(gòu)買(mǎi)的10只小鼠為正常對(duì)照組。對(duì)照組、糖尿病模型組小鼠飼喂正常小鼠日糧。糖尿病模型+丁酸鈉組小鼠在日糧中添加3%丁酸鈉。實(shí)驗(yàn)持續(xù)7周。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 血糖和胰島素水平測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)小鼠禁食12h后摘除眼球法采血。采出的全血立即用醫(yī)用血糖測(cè)試紙和三諾血糖測(cè)試儀測(cè)定血糖水平。其余全血凝固析出血清后，3 000r/min離心5min分離血清，置于-70℃冰箱中保存，用小鼠胰島素ELISA試劑盒測(cè)定胰島素含量。

1.5.2 盲腸內(nèi)容物中腸桿菌、腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、雙歧桿菌和乳酸菌數(shù)量測(cè)定

采完血后頸椎脫臼處死小鼠，剖開(kāi)腹腔，無(wú)菌采集盲腸內(nèi)容物用于培養(yǎng)腸道細(xì)菌。腸道細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)的具體操作：無(wú)菌取盲腸內(nèi)容物0.1g，加入0.9mL無(wú)菌生理鹽水，用移液器吸吹混勻后用無(wú)菌生理鹽水連續(xù)10倍稀釋至10-9。每次稀釋不同濃度時(shí)更換吸頭，稀釋時(shí)吸頭不要碰到試管及試管內(nèi)的液體。分別選擇合適的稀釋度對(duì)腸桿菌、腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、雙歧桿菌和乳酸菌用各自的選擇性培養(yǎng)基(分別為伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、疊氮鈉—結(jié)晶紫—七葉苷瓊脂、胰月示—亞硫酸鹽—環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基、BBL瓊脂培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基)進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。其中雙歧桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌采用平板夾心法厭氧培養(yǎng)[8]，其它細(xì)菌采用需氧培養(yǎng)。腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌37℃培養(yǎng)24h，其他菌37℃培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后用細(xì)菌計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，最終以每克盲腸內(nèi)容物中細(xì)菌個(gè)數(shù)的對(duì)數(shù) lg(CFU/g) 表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并用Ducan's進(jìn)行多重比較。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 丁酸鈉對(duì)1型糖尿病模型小鼠血糖和血清胰島素水平的影響

各組血糖和血清胰島素水平測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，糖尿病模型組小鼠的血糖水平極顯著升高(P<0.01)，血清胰島素水平極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，說(shuō)明模型制作和維持成功。糖尿病模型+丁酸鈉組血糖水平極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，胰島素水平顯著降低低于對(duì)照組(P<0.05)，但血糖水平極顯著低于糖尿病模型組(P<0.01)，血清胰島素水平極顯著高于糖尿病模型組(P<0.01)。說(shuō)明日糧中添加丁酸鈉對(duì)治療糖尿病有一定作用，但尚不能完全恢復(fù)到正常狀態(tài)。

2.2 丁酸鈉對(duì)糖尿病模型小鼠盲腸內(nèi)容物腸桿菌、腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、雙歧桿菌和乳酸菌數(shù)量的影響

從圖2可見(jiàn)，糖尿病模型組雙歧桿菌和乳酸菌數(shù)量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，腸桿菌和腸球菌數(shù)量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。說(shuō)明糖尿病模型小鼠腸道菌群組成發(fā)生了異常，有益菌數(shù)量減少，有害菌數(shù)量增加。與模型組相比，丁酸鈉能顯著增加盲腸中乳酸菌(P<0.05)、雙歧桿菌數(shù)量(P<0.05)，降低盲腸中腸桿菌(P<0.01)、產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量(P<0.05)，對(duì)盲腸中腸球菌有降低趨勢(shì)(P>0.05)。說(shuō)明丁酸鈉對(duì)糖尿病模型小鼠的腸道菌群組成有一定的恢復(fù)作用，但同樣未能恢復(fù)到正常狀態(tài)。

A：腸桿菌 B：腸球菌 C：產(chǎn)氣莢膜梭菌 D：雙歧桿菌 E：乳酸菌

3 討 論

研究表明一次性大劑量注射或連續(xù)多次小劑量注射鏈脲佐菌素時(shí)，由于鏈脲佐菌素直接引起胰島β細(xì)胞的廣泛破壞，可造成1型糖尿病動(dòng)物模型[9]；而注射較少量鏈脲佐菌素，同時(shí)在造模前就開(kāi)始給予高熱量飼料喂養(yǎng)，可誘導(dǎo)出2型糖尿病動(dòng)物模型[10]。本研究采用大劑量一次性腹腔注射鏈脲佐菌素，采用常規(guī)日糧飼喂，因此制備的模型屬于1型糖尿病模型。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，模型組小鼠血糖顯著升高，胰島素水平顯著降低，并且表現(xiàn)出多飲多尿的臨床癥狀，符合1型糖尿病的特點(diǎn)，說(shuō)明模型制備非常成功。

雖然目前普遍認(rèn)為1 型糖尿病是一種多基因遺傳缺陷相關(guān)的代謝紊亂疾病，但有研究表明同卵雙胞胎共同患病的機(jī)率只有約 50%[11]，說(shuō)明有已知的和未知的環(huán)境因素對(duì)該病的觸發(fā)起重要作用。不良飲食習(xí)慣可能是觸發(fā)糖尿病發(fā)生的重要環(huán)境因素之一。而腸道菌群可能是連接飲食觸發(fā)糖尿病的橋梁。飲食對(duì)腸道菌群組成有非常強(qiáng)烈的影響。腸道菌群不僅影響機(jī)體的能量代謝，也影響機(jī)體的免疫系統(tǒng)特別是腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟[12-13]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群紊亂可能通過(guò)改變腸壁通透性及機(jī)體免疫功能參與了1型糖尿病的發(fā)展進(jìn)程[14]。關(guān)于1型糖尿病時(shí)腸道菌群的變化，目前報(bào)道尚不一致。Murri等[15]采用PCR-DGGE和熒光定量PCR法發(fā)現(xiàn)在屬水平上，1型糖尿病兒童中梭菌屬、擬桿菌屬和韋榮球菌屬的數(shù)量顯著增加，乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、Blautia coccoides/Eubacterium rectale 和普雷沃氏菌屬的數(shù)量顯著降低。齊翠娟[16]通過(guò)對(duì)糞便細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)擴(kuò)增和高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)1型糖尿病兒童腸道菌群中在屬水平上，嗜血桿菌屬、毛螺菌屬、小類(lèi)桿菌屬和氨基酸球菌屬、Defluviitaleaceae科下的未分類(lèi)屬的豐度顯著降低，而B(niǎo)lautia屬的豐度顯著升高。徐靈筠[17]用糞便細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)-DGGE法研究了健康小鼠、鏈脲佐菌素致1型糖尿病模型小鼠和模型未成功小鼠腸道菌群的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌和腸乳桿菌的數(shù)量下降與發(fā)生糖尿病有關(guān)。任曉燕[18]采用熒光定量PCR法比較1型糖尿病兒童和健康兒童糞便中5個(gè)菌屬(大腸桿菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬)的差異，發(fā)現(xiàn)1型糖尿病兒童雙歧桿菌屬數(shù)量顯著減少；大腸桿菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、擬桿菌屬的數(shù)量沒(méi)有顯著變化。朱華等[19]給大鼠連續(xù)5d腹腔注射鏈脲佐菌素[劑量為30mg/(kg·BW)]制備1型糖尿病模型，通過(guò)糞便細(xì)菌16S rDNA-V3區(qū)測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)造模4周時(shí)，模型組乳桿菌屬相對(duì)豐度顯著降低、擬桿菌屬相對(duì)豐度顯著增高；造模12周，模型組乳桿菌屬、瘤胃球菌屬、擬桿菌屬相對(duì)豐度顯著增高，雙歧桿菌屬相對(duì)豐度顯著降低。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病模型組雙歧桿菌和乳酸菌數(shù)量均顯著低于對(duì)照組，腸桿菌和腸球菌數(shù)量極顯著高于對(duì)照組，產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量顯著高于對(duì)照組。上述這些差異可能與采用的實(shí)驗(yàn)對(duì)象、研究方法不同有關(guān)。但比較一致的結(jié)果是多數(shù)研究表明1型糖尿病發(fā)病后會(huì)降低腸道中有益菌(如乳桿菌和雙歧桿菌)的數(shù)量。

雖然1型糖尿病 患者顯示腸道微生態(tài)失衡，但目前還不清楚這是觸發(fā)1型糖尿病的原因還是1型糖尿病所導(dǎo)致的結(jié)果[20]。本研究中，采用腹腔注射鏈脲佐菌素破壞胰島快速引起糖尿病，與自然發(fā)病過(guò)程慢慢發(fā)展而成的糖尿病相比，其對(duì)腸道菌群的影響可能會(huì)存在一些差異。雖然在自然發(fā)生的糖尿病和藥物引起的糖尿病中，糖尿病與腸道菌群之間的因果關(guān)系可能存在差異，但在兩種不同因素導(dǎo)致的糖尿病發(fā)展一段時(shí)間后，兩者的腸道菌群組成可能會(huì)出現(xiàn)趨同。這是因?yàn)樘悄虿∫矔?huì)對(duì)腸道菌群產(chǎn)生影響。一方面，糖尿病患者飲食量增加，從而通過(guò)增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝入量影響腸道菌群的組成；另一方面，糖尿病時(shí)的高血糖會(huì)降低腸上皮細(xì)胞的胞外谷胱苷肽水平，上調(diào)一氧化氮合成酶的表達(dá)水平，導(dǎo)致腸道環(huán)境的氧化應(yīng)激水平上升，這將會(huì)給腸道菌群的定植產(chǎn)生壓力，導(dǎo)致乳桿菌數(shù)量顯著減少[17]。

丁酸是腸粘膜上皮細(xì)胞的首要能量來(lái)源，是維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、調(diào)節(jié)基因表達(dá)及調(diào)節(jié)腸道炎癥反應(yīng)的主要成分[21]。表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg細(xì)胞)在限制腸道炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[22]。丁酸能調(diào)節(jié)結(jié)腸Treg細(xì)胞池的大小和功能，從而減輕腸道炎癥[23]。丁酸鈉可以預(yù)防和治療飲食誘導(dǎo)的小鼠胰島素抵抗(即2型糖尿病)，其機(jī)制與促進(jìn)能量消耗和改善線(xiàn)粒體功能有關(guān)[24]。Tian等[25]研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加丁酸鈉可以使草魚(yú)腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量明顯下降，而乳酸桿菌數(shù)量顯著增加，從而改善了腸道菌群組成。本研究也發(fā)現(xiàn)添加丁酸鈉可以增加1型糖尿病模型小鼠腸道乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量，減少有害菌數(shù)量。有較多研究表明服用短乳桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌等益生菌可以改善1型糖尿病[26]。說(shuō)明通過(guò)日糧添加丁酸鈉可以彌補(bǔ)1型糖尿病模型腸道中產(chǎn)丁酸菌減少的不良后果，并通過(guò)改善腸道菌群結(jié)構(gòu)和降低腸道炎癥反應(yīng)等途徑緩解1型糖尿病的病情。

4 結(jié) 論

鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的1型糖尿病模型小鼠腸道菌群組成會(huì)發(fā)生紊亂，表現(xiàn)為有益菌數(shù)量減少，有害菌數(shù)量增多。丁酸鈉對(duì)1型糖尿病有一定的治療作用，其機(jī)制是否與改善腸道菌群組成有關(guān)需要進(jìn)一步研究。今后有必要對(duì)丁酸鈉的適宜劑量、包被后的使用效果進(jìn)行研究，以便為將其用于1型糖尿病患者的輔助治療和保健提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。