周 鷹 吳美麗 朱晗婷 崔玉寶③

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市兒童醫(yī)院兒科實(shí)驗(yàn)室，無錫214023)

塵螨種類較多，其中有30余種與人類疾病密切相關(guān)，是過敏性哮喘、過敏性鼻炎和消化道過敏性疾病的重要危險因素[1]。塵螨及其過敏原通過氧化反應(yīng)損傷肺細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA，通過酶水解作用引起胃腸道炎癥[2]。我國呼吸道過敏性疾病研究聯(lián)盟對17座城市6 304例哮喘合并/或鼻炎患者進(jìn)行了調(diào)查，粉塵螨、屋塵螨和熱帶無爪螨皮膚挑刺試驗(yàn)陽性率分別為59%、57.6%和40.7%，說明此3種螨是我國過敏性疾病常見致敏螨種[3]。

引起過敏性疾病的抗原物質(zhì)稱為過敏原。世界衛(wèi)生組織/國際免疫聯(lián)合會根據(jù)生物體產(chǎn)生的過敏原的發(fā)現(xiàn)順序及氨基酸序列同源性予以命名，已公布屋塵螨過敏原23組分、粉塵螨過敏原32組分、熱帶無爪螨過敏原14組分。2013年，澳大利亞學(xué)者Weghofer等[4]報道從屋塵螨gt11cDNA表達(dá)文庫中篩選出過敏原Der p 23，其大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物可與74%屋塵螨過敏患者血清結(jié)合，陽性率高于過敏原主要組分Der p 1和Der p 2，因此被認(rèn)為是新發(fā)現(xiàn)的屋塵螨過敏原主要組分。本研究制備屋塵螨重組蛋白Der p 23，建立了化學(xué)發(fā)光法檢測該組分與屋塵螨過敏性疾病患者血清IgE結(jié)合率，結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1血清 采集南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科過敏原檢測獲得的屋塵螨過敏原陽性血清(Mediwiss Analytic GmbH，德國)，且乙肝表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎抗體(抗-HCV抗體)、人類免疫缺陷病毒1/2抗體(抗-HIV 1/2抗體)和梅毒螺旋體抗體(抗-TP抗體)均為陰性。所有血清經(jīng)確認(rèn)屋塵螨過敏原特異性陽性，即特異性IgE > 0.35 KU/L。陽性血清中，2例1級、11例2級、15例3級、7例4級、5例5級、9例6級，患者的臨床診斷為過敏性鼻炎或/和過敏性哮喘。本研究經(jīng)無錫市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審查號：KYLLH2018034)，因所用血清樣本為臨床檢驗(yàn)剩余樣本，無需知情同意。

1.1.2試劑 載體pET28a(+)和大腸埃希氏菌菌株E.coliBL21(DE3)plysS為本實(shí)驗(yàn)保存。工具酶BamHⅠ和NotⅠ、DNA ladder、E.coliCompetent Cells JM109 (Code No.D9052)、RNAiso Plus Kit (Code No.9108Q)、PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Code No.RR014A)、TksGflex DNA Polymerase Kit(Code No.R060A)、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(Code No.9762)購自TaKaRa公司；In-Fusion?HD Cloning Kit (Code No.639648)購自Clontech公司；HiTrap TALON crude、5ml TALON Superflow (Code No.28-9537-66)購自美國GE公司；RNAeasy Mini Kit (Qiagen 74104)購自Qiagen公司；HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG購自Zymed Laboratories(CA,USA)；PVDF膜、Western blot膜封閉液、CBB-R250染色液購自天根生化科技有限公司；BCIP/NBT購自Roche公司；親和色譜填料鎳瓊脂糖凝膠FF購自北京卓冠科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3儀器 Phadia過敏原檢測儀(ImmunoCAP System,ThermofisherScienfific,Uppsala,Sweden)購自美國賽默飛；PCR儀(Cat No.TP600)購自TaKaRa公司；Mupid電泳儀購自Advance-Bio 公司；ImageMaster?VDS電泳成像裝置購自Pharmacia Biotech公司；ABI PRISM TM 377XL DNA Sequencer DNA測序儀購自Perkin Elmer公司。

1.2方法

1.2.1屋塵螨培養(yǎng) 根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]培養(yǎng)屋塵螨，培養(yǎng)基為酵母粉和魚食按一定比例混合，置于25.1℃、相對濕度(75±5)%培養(yǎng)。

1.2.2引物設(shè)計與合成 依據(jù)GenBank公布的序列(No.EU414751)，去掉5′端21個氨基酸的編碼序列，設(shè)計并合成引物，F(xiàn)：5′-AATGGGTCGCGGATCCGCCAATGATAATGATGATGATCCTACC-3′，R： 5′-T-GCTCGAGTGCGGCCGCTTAAGTGCATGTTTCTTCATC-TTCATTC-3′，片段兩側(cè)添加BamHⅠ/NotⅠ 酶切位點(diǎn)。

1.2.3質(zhì)粒pET28a(+)-Der p 23構(gòu)建 用RNAiso Plus Kit提取屋塵螨Total RNA，以Total RNA為模板，使用PrimeScriptTMRT-PCR Kit合成cDNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以INF1/INR1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，使用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.切膠回收目的擴(kuò)增條帶，使用In-Fusion?HD Cloning Kit將回收的目的基因與質(zhì)粒pET28a(+)進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化至E.coliCompetent Cells JM109中，挑選陽性菌落植菌，提取質(zhì)粒，使用引物T7、T7terminator進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.2.4目的蛋白表達(dá)、純化與鑒定 取1 μl質(zhì)粒pET28a(+)-Der p 23轉(zhuǎn)化至Competent cell Rosetta 2(DE3) pLysS中，各取80 μl 轉(zhuǎn)化液分別涂布含于抗生素Kana(50 μg/ml) 平板和LB抗生素Kana(50 μg/ml)+Cm(34 μg/ml) 平板，37℃培養(yǎng)過夜。以空質(zhì)粒pET28a(+)為對照同步操作。挑取單菌落分別放置于2 ml LB/Kana(50 μg/ml)和2 ml LB/Kana(50 μg/ml) + Cm(34 μg/ml)培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。行主培養(yǎng)誘導(dǎo)，在Glass tube中加入5 ml LB/Kana(50 μg/ml)和5 ml LB/Kana(50 μg/ml) + Cm(34 μg/ml)培養(yǎng)基，添加培養(yǎng)菌液100 μl。37℃培養(yǎng)至OD600為0.6，加入150 mmol IPTG 34 μl(final 1 mmol IPTG) 進(jìn)行誘導(dǎo)，37℃培養(yǎng)4 h。集菌前吸光度值為1.80，集菌后，在菌體中加入320 μl PBS懸濁后進(jìn)行超聲波破碎，12 000 r/min離心5 min。取全蛋白提取物、上清液、沉淀物各8 μl，加入2 μl 4×SDS Loading Buffer，95℃加熱10 min，行SDS-PAGE電泳。電泳條件：25 mA/枚、70 min，12.5% polyacrylamide gel，CBB-R250染色，脫色液脫色。轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜置于含1.5% BSA 的12 ml Blocking Buffer 中，4℃平放過夜封閉。取稀釋后的Penta-His Antibody溶液9 ml，加入一抗反應(yīng)1 h。TBST緩沖液(20 ml)洗滌2次，TBS緩沖液沖洗3次。使用稀釋后的HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG抗體溶液9 ml，加入二抗反應(yīng)1 h。TBST緩沖液(20 ml)洗滌2次，TBS緩沖液沖洗3次。1 ml TrueBlue Peroxidase Substrate顯色1 min。

1.2.5化學(xué)發(fā)光檢測方法的建立 取重組蛋白，配制成5 μg/ml溶液。按照說明書操作：①包被：采用重組蛋白包被化學(xué)發(fā)光板，2～8℃過夜，加150 μl 4% BSA-PBS，37℃封閉2 h，置于37℃干燥2 h;②加樣：取重組過敏原包被的化學(xué)發(fā)光板，50 μl/孔加入樣品稀釋液混勻。質(zhì)控品孔中加入100 μl SS2(磷酸鹽緩沖液，含3.5 U/ml 人IgE、2% BSA和0.25%%Proclin-300)和SS4(磷酸鹽緩沖液、含17.51 U/ml 人IgE、含2% BSA和0.25 Proclin-300);③孵育：用封板膜封好包被板，37℃孵育45 min；④洗板：每孔加入不少于350 μl稀釋好的工作洗液，靜置30 min，拍干，共洗板5次;⑤第2次加樣：100 μl/孔加入酶結(jié)合物；⑥孵育；⑦洗板；⑧加發(fā)光底物液：每孔加入底物A液(檸檬酸-氫氧化鈉緩沖液、Luminol)和B液(檸檬酸-乙酸鈉緩沖液、過氧化氫脲)各50 μl，振蕩混勻，室溫避光放置5 min;⑨化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測量每孔RLU;⑩結(jié)果計算：選用雙對數(shù)擬合軟件自動計算出待測樣本結(jié)果。

1.2.6方法學(xué)比對 以美國賽默飛Phadia過敏原診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計算本文化學(xué)發(fā)光法檢測的Der p 23特異性IgE陰性、陽性測定值，并進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組樣本率比較采用χ2檢驗(yàn)，以曲線下面積(AUC)作為衡量依據(jù)，取Youden指數(shù)最大時作為最佳截斷(Cut-off)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1屋塵螨過敏原Der p 23重組蛋白制備結(jié)果 以屋塵螨Total RNA為模板,RT-PCR擴(kuò)增Der p 23的活性部位編碼基因見圖1，將構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-Der p 23轉(zhuǎn)化至Competent cell Rosetta 2(DE3) pLysS中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，柱層析純化，獲得目的蛋白0.5 ml，濃度為0.25 mg/ml，純度>95%，SDS-PAGE鑒定結(jié)果及Western blot目的條帶結(jié)果見圖2。

2.2化學(xué)發(fā)光檢測方法的建立 以國際通行的>0.35 U/ml為閾值判定標(biāo)準(zhǔn)，49例患者中，有44例與重組蛋白Der p 23反應(yīng)，反應(yīng)率為89.8%。以UniCAP方法同步檢測呈過敏性疾病患者血清，47例呈陽性，陽性反應(yīng)率為95.92%。兩種方法檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.237，P=0.626)。以UniCAP方法為狀態(tài)變量，以本文所建化學(xué)發(fā)光法作為檢驗(yàn)變量，繪制ROC曲線，AUC為0.952。見圖3。

圖1 Der p 23 PCR產(chǎn)物電泳圖和序列測定結(jié)果Fig.1 PCR amplification of Der p 23 identified by agarose electrophoresis and nucleotide sequencing Note:A.PCR agarose electrophoresis;B.Nucleotide sequencing.M1.DL2000 DNA Marker;1.pET28a(+)-Der p 23;2.RT-PCR product of Der p 23.

圖2 純化后的重組蛋白鑒定Fig.2 Identification of recombinant protein after purificationNote:A.SDS-PAGE;B.Western blot;M.Protein MW marker(broad);1.2 μl of recombinant protein; 2.4 μl of recombinant protein;3.200 ng BSA;4.500 ng BSA;5.1 000 ng BSA;6.1 500 ng BSA;7.2 000 ng BSA.B.M1.Precision plus protein standards; 8.1 μl recombinant protein;M2.Perfect protein marker.

圖3 塵螨過敏原Der p 23特異性IgE化學(xué)發(fā)光法ROC曲線Fig.3 ROC curve for Der p 23 specific IgE detected by chemiluminescence

3 討論

Chua等[6]報道了屋塵螨過敏原第1組分cDNA克隆和基因序列。目前，世界衛(wèi)生組織/國際免疫聯(lián)合會官網(wǎng)(www.allergen.org)已公布屋塵螨過敏原23組分，其中第1組分Der p 1和第2組分Der p 2與屋塵螨過敏性疾病患者血清IgE結(jié)合率為60%～100%，被認(rèn)為是主要組分。在粗提浸液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化時，以第1、2組分濃度測定為依據(jù)。近年發(fā)現(xiàn)屋塵螨過敏原第23組分Der p 23也是過敏原的主要組分，與Der p 1、Der p 2具有同等重要的臨床價值，其血清IgE結(jié)合率高達(dá)46%～74%[7]。Der p 23位于螨糞球幾丁質(zhì)膜，嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒試驗(yàn)顯示其活性較高[8]。本研究檢測49例屋塵螨過敏性疾病患者血清，Der p 23單組分反應(yīng)率高達(dá)89.8%，表明該組分過敏原是我國過敏性疾病患者重要的致敏蛋白之一。

目前，臨床檢測過敏原主要采用塵螨粗提浸液制品為包被抗原，不同批次產(chǎn)品含有的過敏原單組分種類及含量不穩(wěn)定，某種或某些組分的免疫原性偏低，含有非過敏原性物質(zhì)，甚至有毒物質(zhì)，所以很難實(shí)現(xiàn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化，從而影響檢測結(jié)果[9，10]。重組DNA技術(shù)為過敏原制備提供了新的手段，重組過敏原單組分的優(yōu)點(diǎn)是物理、化學(xué)、免疫學(xué)特征明確。用純化或重組的過敏原單組分進(jìn)行組分分辨診斷能夠從分子水平檢測患者過敏譜，提高診斷精準(zhǔn)性，從交叉反應(yīng)中鑒別出致敏原單組分，評估過敏反應(yīng)類型，幫助臨床選擇合適的過敏原單組分進(jìn)行脫敏治療[11，12]。北京協(xié)和新華聯(lián)公司銷售的化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測試劑盒檢測過敏原特異性IgE采用的是粗提過敏原浸液，包括蒿屬花粉、屋塵螨、花生等22種。本文參考該試劑盒說明書，以重組過敏原單組分包被化學(xué)發(fā)光板建立了化學(xué)發(fā)光檢測方法，檢測了針對Der p 23的特異性IgE。美國賽默飛Phadia過敏原診斷系統(tǒng)采用粗提浸液為包被抗原，已開發(fā)出Der p 1、Der p 2、Der p 23的單組分檢測試劑，但目前僅限于科學(xué)研究使用。比較本文建立的化學(xué)發(fā)光免疫分析法和Phadia過敏原Der p 23檢測結(jié)果，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明本文成功建立了過敏原單組分化學(xué)發(fā)光免疫分析法。