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        過敏原Der p 23重組蛋白制備及其特異性IgE化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法的建立①

        2020-12-25 00:30:00吳美麗朱晗婷崔玉寶
        中國免疫學(xué)雜志 2020年20期
        關(guān)鍵詞:單組分塵螨化學(xué)發(fā)光

        周 鷹 吳美麗 朱晗婷 崔玉寶③

        (南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市兒童醫(yī)院兒科實(shí)驗(yàn)室,無錫214023)

        塵螨種類較多,其中有30余種與人類疾病密切相關(guān),是過敏性哮喘、過敏性鼻炎和消化道過敏性疾病的重要危險(xiǎn)因素[1]。塵螨及其過敏原通過氧化反應(yīng)損傷肺細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA,通過酶水解作用引起胃腸道炎癥[2]。我國呼吸道過敏性疾病研究聯(lián)盟對(duì)17座城市6 304例哮喘合并/或鼻炎患者進(jìn)行了調(diào)查,粉塵螨、屋塵螨和熱帶無爪螨皮膚挑刺試驗(yàn)陽性率分別為59%、57.6%和40.7%,說明此3種螨是我國過敏性疾病常見致敏螨種[3]。

        引起過敏性疾病的抗原物質(zhì)稱為過敏原。世界衛(wèi)生組織/國際免疫聯(lián)合會(huì)根據(jù)生物體產(chǎn)生的過敏原的發(fā)現(xiàn)順序及氨基酸序列同源性予以命名,已公布屋塵螨過敏原23組分、粉塵螨過敏原32組分、熱帶無爪螨過敏原14組分。2013年,澳大利亞學(xué)者Weghofer等[4]報(bào)道從屋塵螨gt11cDNA表達(dá)文庫中篩選出過敏原Der p 23,其大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物可與74%屋塵螨過敏患者血清結(jié)合,陽性率高于過敏原主要組分Der p 1和Der p 2,因此被認(rèn)為是新發(fā)現(xiàn)的屋塵螨過敏原主要組分。本研究制備屋塵螨重組蛋白Der p 23,建立了化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)該組分與屋塵螨過敏性疾病患者血清IgE結(jié)合率,結(jié)果報(bào)告如下。

        1 材料與方法

        1.1材料

        1.1.1血清 采集南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科過敏原檢測(cè)獲得的屋塵螨過敏原陽性血清(Mediwiss Analytic GmbH,德國),且乙肝表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎抗體(抗-HCV抗體)、人類免疫缺陷病毒1/2抗體(抗-HIV 1/2抗體)和梅毒螺旋體抗體(抗-TP抗體)均為陰性。所有血清經(jīng)確認(rèn)屋塵螨過敏原特異性陽性,即特異性IgE > 0.35 KU/L。陽性血清中,2例1級(jí)、11例2級(jí)、15例3級(jí)、7例4級(jí)、5例5級(jí)、9例6級(jí),患者的臨床診斷為過敏性鼻炎或/和過敏性哮喘。本研究經(jīng)無錫市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審查號(hào):KYLLH2018034),因所用血清樣本為臨床檢驗(yàn)剩余樣本,無需知情同意。

        1.1.2試劑 載體pET28a(+)和大腸埃希氏菌菌株E.coliBL21(DE3)plysS為本實(shí)驗(yàn)保存。工具酶BamHⅠ和NotⅠ、DNA ladder、E.coliCompetent Cells JM109 (Code No.D9052)、RNAiso Plus Kit (Code No.9108Q)、PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Code No.RR014A)、TksGflex DNA Polymerase Kit(Code No.R060A)、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(Code No.9762)購自TaKaRa公司;In-Fusion?HD Cloning Kit (Code No.639648)購自Clontech公司;HiTrap TALON crude、5ml TALON Superflow (Code No.28-9537-66)購自美國GE公司;RNAeasy Mini Kit (Qiagen 74104)購自Qiagen公司;HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG購自Zymed Laboratories(CA,USA);PVDF膜、Western blot膜封閉液、CBB-R250染色液購自天根生化科技有限公司;BCIP/NBT購自Roche公司;親和色譜填料鎳瓊脂糖凝膠FF購自北京卓冠科技有限公司產(chǎn)品。

        1.1.3儀器 Phadia過敏原檢測(cè)儀(ImmunoCAP System,ThermofisherScienfific,Uppsala,Sweden)購自美國賽默飛;PCR儀(Cat No.TP600)購自TaKaRa公司;Mupid電泳儀購自Advance-Bio 公司;ImageMaster?VDS電泳成像裝置購自Pharmacia Biotech公司;ABI PRISM TM 377XL DNA Sequencer DNA測(cè)序儀購自Perkin Elmer公司。

        1.2方法

        1.2.1屋塵螨培養(yǎng) 根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]培養(yǎng)屋塵螨,培養(yǎng)基為酵母粉和魚食按一定比例混合,置于25.1℃、相對(duì)濕度(75±5)%培養(yǎng)。

        1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成 依據(jù)GenBank公布的序列(No.EU414751),去掉5′端21個(gè)氨基酸的編碼序列,設(shè)計(jì)并合成引物,F(xiàn):5′-AATGGGTCGCGGATCCGCCAATGATAATGATGATGATCCTACC-3′,R: 5′-T-GCTCGAGTGCGGCCGCTTAAGTGCATGTTTCTTCATC-TTCATTC-3′,片段兩側(cè)添加BamHⅠ/NotⅠ 酶切位點(diǎn)。

        1.2.3質(zhì)粒pET28a(+)-Der p 23構(gòu)建 用RNAiso Plus Kit提取屋塵螨Total RNA,以Total RNA為模板,使用PrimeScriptTMRT-PCR Kit合成cDNA,以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,以INF1/INR1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,使用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.切膠回收目的擴(kuò)增條帶,使用In-Fusion?HD Cloning Kit將回收的目的基因與質(zhì)粒pET28a(+)進(jìn)行連接反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化至E.coliCompetent Cells JM109中,挑選陽性菌落植菌,提取質(zhì)粒,使用引物T7、T7terminator進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

        1.2.4目的蛋白表達(dá)、純化與鑒定 取1 μl質(zhì)粒pET28a(+)-Der p 23轉(zhuǎn)化至Competent cell Rosetta 2(DE3) pLysS中,各取80 μl 轉(zhuǎn)化液分別涂布含于抗生素Kana(50 μg/ml) 平板和LB抗生素Kana(50 μg/ml)+Cm(34 μg/ml) 平板,37℃培養(yǎng)過夜。以空質(zhì)粒pET28a(+)為對(duì)照同步操作。挑取單菌落分別放置于2 ml LB/Kana(50 μg/ml)和2 ml LB/Kana(50 μg/ml) + Cm(34 μg/ml)培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)過夜。行主培養(yǎng)誘導(dǎo),在Glass tube中加入5 ml LB/Kana(50 μg/ml)和5 ml LB/Kana(50 μg/ml) + Cm(34 μg/ml)培養(yǎng)基,添加培養(yǎng)菌液100 μl。37℃培養(yǎng)至OD600為0.6,加入150 mmol IPTG 34 μl(final 1 mmol IPTG) 進(jìn)行誘導(dǎo),37℃培養(yǎng)4 h。集菌前吸光度值為1.80,集菌后,在菌體中加入320 μl PBS懸濁后進(jìn)行超聲波破碎,12 000 r/min離心5 min。取全蛋白提取物、上清液、沉淀物各8 μl,加入2 μl 4×SDS Loading Buffer,95℃加熱10 min,行SDS-PAGE電泳。電泳條件:25 mA/枚、70 min,12.5% polyacrylamide gel,CBB-R250染色,脫色液脫色。轉(zhuǎn)膜,將PVDF膜置于含1.5% BSA 的12 ml Blocking Buffer 中,4℃平放過夜封閉。取稀釋后的Penta-His Antibody溶液9 ml,加入一抗反應(yīng)1 h。TBST緩沖液(20 ml)洗滌2次,TBS緩沖液沖洗3次。使用稀釋后的HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG抗體溶液9 ml,加入二抗反應(yīng)1 h。TBST緩沖液(20 ml)洗滌2次,TBS緩沖液沖洗3次。1 ml TrueBlue Peroxidase Substrate顯色1 min。

        1.2.5化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法的建立 取重組蛋白,配制成5 μg/ml溶液。按照說明書操作:①包被:采用重組蛋白包被化學(xué)發(fā)光板,2~8℃過夜,加150 μl 4% BSA-PBS,37℃封閉2 h,置于37℃干燥2 h;②加樣:取重組過敏原包被的化學(xué)發(fā)光板,50 μl/孔加入樣品稀釋液混勻。質(zhì)控品孔中加入100 μl SS2(磷酸鹽緩沖液,含3.5 U/ml 人IgE、2% BSA和0.25%%Proclin-300)和SS4(磷酸鹽緩沖液、含17.51 U/ml 人IgE、含2% BSA和0.25 Proclin-300);③孵育:用封板膜封好包被板,37℃孵育45 min;④洗板:每孔加入不少于350 μl稀釋好的工作洗液,靜置30 min,拍干,共洗板5次;⑤第2次加樣:100 μl/孔加入酶結(jié)合物;⑥孵育;⑦洗板;⑧加發(fā)光底物液:每孔加入底物A液(檸檬酸-氫氧化鈉緩沖液、Luminol)和B液(檸檬酸-乙酸鈉緩沖液、過氧化氫脲)各50 μl,振蕩混勻,室溫避光放置5 min;⑨化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)量每孔R(shí)LU;⑩結(jié)果計(jì)算:選用雙對(duì)數(shù)擬合軟件自動(dòng)計(jì)算出待測(cè)樣本結(jié)果。

        1.2.6方法學(xué)比對(duì) 以美國賽默飛Phadia過敏原診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算本文化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的Der p 23特異性IgE陰性、陽性測(cè)定值,并進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

        1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組樣本率比較采用χ2檢驗(yàn),以曲線下面積(AUC)作為衡量依據(jù),取Youden指數(shù)最大時(shí)作為最佳截?cái)?Cut-off)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1屋塵螨過敏原Der p 23重組蛋白制備結(jié)果 以屋塵螨Total RNA為模板,RT-PCR擴(kuò)增Der p 23的活性部位編碼基因見圖1,將構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-Der p 23轉(zhuǎn)化至Competent cell Rosetta 2(DE3) pLysS中,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),柱層析純化,獲得目的蛋白0.5 ml,濃度為0.25 mg/ml,純度>95%,SDS-PAGE鑒定結(jié)果及Western blot目的條帶結(jié)果見圖2。

        2.2化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法的建立 以國際通行的>0.35 U/ml為閾值判定標(biāo)準(zhǔn),49例患者中,有44例與重組蛋白Der p 23反應(yīng),反應(yīng)率為89.8%。以UniCAP方法同步檢測(cè)呈過敏性疾病患者血清,47例呈陽性,陽性反應(yīng)率為95.92%。兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.237,P=0.626)。以UniCAP方法為狀態(tài)變量,以本文所建化學(xué)發(fā)光法作為檢驗(yàn)變量,繪制ROC曲線,AUC為0.952。見圖3。

        圖1 Der p 23 PCR產(chǎn)物電泳圖和序列測(cè)定結(jié)果Fig.1 PCR amplification of Der p 23 identified by agarose electrophoresis and nucleotide sequencing Note:A.PCR agarose electrophoresis;B.Nucleotide sequencing.M1.DL2000 DNA Marker;1.pET28a(+)-Der p 23;2.RT-PCR product of Der p 23.

        圖2 純化后的重組蛋白鑒定Fig.2 Identification of recombinant protein after purificationNote:A.SDS-PAGE;B.Western blot;M.Protein MW marker(broad);1.2 μl of recombinant protein; 2.4 μl of recombinant protein;3.200 ng BSA;4.500 ng BSA;5.1 000 ng BSA;6.1 500 ng BSA;7.2 000 ng BSA.B.M1.Precision plus protein standards; 8.1 μl recombinant protein;M2.Perfect protein marker.

        圖3 塵螨過敏原Der p 23特異性IgE化學(xué)發(fā)光法ROC曲線Fig.3 ROC curve for Der p 23 specific IgE detected by chemiluminescence

        3 討論

        Chua等[6]報(bào)道了屋塵螨過敏原第1組分cDNA克隆和基因序列。目前,世界衛(wèi)生組織/國際免疫聯(lián)合會(huì)官網(wǎng)(www.allergen.org)已公布屋塵螨過敏原23組分,其中第1組分Der p 1和第2組分Der p 2與屋塵螨過敏性疾病患者血清IgE結(jié)合率為60%~100%,被認(rèn)為是主要組分。在粗提浸液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化時(shí),以第1、2組分濃度測(cè)定為依據(jù)。近年發(fā)現(xiàn)屋塵螨過敏原第23組分Der p 23也是過敏原的主要組分,與Der p 1、Der p 2具有同等重要的臨床價(jià)值,其血清IgE結(jié)合率高達(dá)46%~74%[7]。Der p 23位于螨糞球幾丁質(zhì)膜,嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒試驗(yàn)顯示其活性較高[8]。本研究檢測(cè)49例屋塵螨過敏性疾病患者血清,Der p 23單組分反應(yīng)率高達(dá)89.8%,表明該組分過敏原是我國過敏性疾病患者重要的致敏蛋白之一。

        目前,臨床檢測(cè)過敏原主要采用塵螨粗提浸液制品為包被抗原,不同批次產(chǎn)品含有的過敏原單組分種類及含量不穩(wěn)定,某種或某些組分的免疫原性偏低,含有非過敏原性物質(zhì),甚至有毒物質(zhì),所以很難實(shí)現(xiàn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化,從而影響檢測(cè)結(jié)果[9,10]。重組DNA技術(shù)為過敏原制備提供了新的手段,重組過敏原單組分的優(yōu)點(diǎn)是物理、化學(xué)、免疫學(xué)特征明確。用純化或重組的過敏原單組分進(jìn)行組分分辨診斷能夠從分子水平檢測(cè)患者過敏譜,提高診斷精準(zhǔn)性,從交叉反應(yīng)中鑒別出致敏原單組分,評(píng)估過敏反應(yīng)類型,幫助臨床選擇合適的過敏原單組分進(jìn)行脫敏治療[11,12]。北京協(xié)和新華聯(lián)公司銷售的化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)試劑盒檢測(cè)過敏原特異性IgE采用的是粗提過敏原浸液,包括蒿屬花粉、屋塵螨、花生等22種。本文參考該試劑盒說明書,以重組過敏原單組分包被化學(xué)發(fā)光板建立了化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法,檢測(cè)了針對(duì)Der p 23的特異性IgE。美國賽默飛Phadia過敏原診斷系統(tǒng)采用粗提浸液為包被抗原,已開發(fā)出Der p 1、Der p 2、Der p 23的單組分檢測(cè)試劑,但目前僅限于科學(xué)研究使用。比較本文建立的化學(xué)發(fā)光免疫分析法和Phadia過敏原Der p 23檢測(cè)結(jié)果,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明本文成功建立了過敏原單組分化學(xué)發(fā)光免疫分析法。

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