許雅麗 李篤妙 吳 強(qiáng) 林俊山

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒外科，福州350005)

近年來(lái)，我國(guó)兒童惡性腫瘤發(fā)病率逐年上升，成為14歲以下兒童死亡的第二大死因，嚴(yán)重影響兒童健康，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)[1-3]。神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Neuroblastoma，NB) 發(fā)病率僅次于白血病、淋巴瘤和顱內(nèi)腫瘤，位列第四，是小兒最常見的顱外實(shí)體瘤，惡性程度高，具有高度浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力，早期即可骨髓轉(zhuǎn)移；Ⅲ～Ⅳ期的5年生存率僅為20%～30%，在目前常用的手術(shù)、化療、放療、介入等多種常規(guī)手段綜合治療下，NB仍然是治療效果最差的兒童惡性實(shí)體腫瘤之一。由于疾病出現(xiàn)隱匿，得不到及時(shí)診療，NB一經(jīng)發(fā)現(xiàn)便已是中晚期[4-6]，且該腫瘤在早期即可出現(xiàn)腫瘤耐受、化療耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致放化療失效，腫瘤進(jìn)展及復(fù)發(fā)。自噬的本質(zhì)是通過降解細(xì)胞內(nèi)變性蛋白、損傷的細(xì)胞器與染色體從而保持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的過程，在細(xì)胞的存活、衰老、死亡中發(fā)揮重要作用，尤其是對(duì)于細(xì)胞免疫的調(diào)控，是目前關(guān)注的焦點(diǎn)。然而，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，自噬過程與細(xì)胞免疫之間的關(guān)系鮮有報(bào)道，因此，探討不同分型的神經(jīng)母細(xì)胞瘤自噬活性與免疫細(xì)胞水平的一致性意義重大。本研究通過分析我院2008年8月～2018年8月期間收治的86例小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤Ⅳ期患者血清免疫細(xì)胞水平與自噬分子的關(guān)系，以期為未來(lái)NB的后期治療等提供臨床參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1資料 收集我院2008年8月～2018年8月期間收治的86例小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤Ⅳ期患者，其中男性患兒53例，女性患兒33例；年齡1～5歲，平均年齡(3.06±1.96)歲。根據(jù)Shimade分型方法，將86例患兒分為①組織結(jié)構(gòu)良好型(favorable histology,FH組)：任何年齡，基質(zhì)豐富，無(wú)結(jié)節(jié)；或年齡在1.5～5歲，基質(zhì)少，組織分化好，瘤細(xì)胞分裂和核碎裂指數(shù)(MKI)<100；或年齡≤1.5歲，基質(zhì)少，而MKI<200；②組織結(jié)構(gòu)不良型(unfavorable histology,UH組)：任何年齡，雖然基質(zhì)豐富而有結(jié)節(jié)者；或基質(zhì)少且年齡>5歲；或年齡在1.5～5歲，基質(zhì)少伴組織分化不良；或年齡在1.5～5歲，雖然基質(zhì)少伴分化好，但MKI>100，或年齡≤1.5歲，但基質(zhì)少并且MKI>200。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡1～5周歲；②均經(jīng)手術(shù)后組織病理活檢確診為NB；③無(wú)糖尿病、心臟病、肝腎功能異常；④KPS評(píng)分≥60分；⑤均可經(jīng)MRI、CT、PET-CT等確診有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；⑥患兒家屬知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有自身免疫疾病或者服用免疫抑制性藥物者；②嚴(yán)重凝血功能和肝腎功能障礙者；③頑固性或持續(xù)性癲癇患兒；④過去1個(gè)月參加過其他臨床研究者。本研究在我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)下進(jìn)行(倫理審批號(hào)：IEC-FOM-013-20)。

1.2方法

1.2.1患者的卡式功能狀態(tài)評(píng)分[10]患者于入院前進(jìn)行一般狀態(tài)評(píng)估，評(píng)估方法采用目前通用的卡式功能狀態(tài)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(見表1)。

1.2.2免疫功能指標(biāo)觀察 清晨抽取患者空腹血5 ml，3 000 r/min離心10 min，獲取細(xì)胞，采用淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行計(jì)數(shù)。淋巴細(xì)胞亞群的正常值范圍如下：CD3+：55%～84%、CD3+CD8+：13%～41%、CD3+CD4+：31%～61%、NK細(xì)胞：5%～27%及B淋巴細(xì)胞：6%～25%。

1.2.3Western blot檢測(cè)LC3、Beclin-1和p62蛋白表達(dá)水平 組織用液氮研磨后，加入RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取40 g總蛋白進(jìn)行 Western blot實(shí)驗(yàn)。12% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜印跡，分別用兔抗大鼠LC3、Beclin-1、p62和β-actin抗體(Cell Signaling Technology，美國(guó))和第二抗體與其反應(yīng)，ECL試劑檢測(cè)，曝光、顯影、定影。采用 Phoretix 1D圖像分析軟件分析Beclin-1和p62表達(dá)情況、LC3降解情況。

表1 KPS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1患兒身體狀態(tài)評(píng)價(jià) 患兒的身體狀態(tài)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示：FH組KPS<70分的6例，KPS=70分的11例，KPS>70分的27例；UH組KPS<70分的8例，KPS=70分的14例，KPS>70分的20例；兩組患兒身體狀態(tài)評(píng)分情況未見顯著差異(χ2=1.643，P=0.440)。

2.2兩組樣本中免疫細(xì)胞水平比較 兩組樣本中CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD4+、NK細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞水平顯示UH組顯著低于FH組(P<0.05)，見表2。

2.3兩組樣本中LC3、Beclin-1和p62蛋白表達(dá)水平比較 Western blot結(jié)果顯示，UH組LC3、Beclin-1和p62蛋白表達(dá)水平顯著低于FH組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。

2.4兩組樣本中免疫細(xì)胞水平與自噬分子水平的一致性分析 兩組樣本中一致性分析結(jié)果顯示，F(xiàn)H組中自噬分子表達(dá)水平與免疫細(xì)胞水平具有顯著一致性(Kappa=0.431，P=0.002；見表3)；而在UH組中自噬分子表達(dá)水平與免疫細(xì)胞水平不具有顯著一致性(Kappa=-0.081，P=0.598；見表4)。

表2 兩組樣本中免疫細(xì)胞水平

圖1 兩組樣本中LC3、Beclin-1和 p62蛋白表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of LC3,Beclin-1 and p62 in two groups of samplesNote:A，B and C show the expression levels of autophagy related proteins LC3,Beclin-1 and p62 in FH and UH groups.

表3 FH組樣本中免疫細(xì)胞水平與自噬分子水平的一致性分析

表4 UH組樣本中免疫細(xì)胞水平與自噬分子水平的一致性分析

3 討論

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是嬰幼兒常見的惡性腫瘤，大量研究表明，該腫瘤具有較強(qiáng)的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，是造成患兒死亡的重要原因[11,12]。神經(jīng)母細(xì)胞瘤一經(jīng)發(fā)現(xiàn)多數(shù)已處于轉(zhuǎn)移狀態(tài)，目前已證實(shí)其以淋巴結(jié)浸潤(rùn)為主。對(duì)于神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療臨床上主要以化放療為主，但治療效果不甚滿意，化療耐受現(xiàn)象較為明顯，并且具體的機(jī)制尚不十分清楚。

自噬指胞漿內(nèi)雙層膜包裹胞質(zhì)及細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分，與溶酶體融合，降解其內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身代謝需要和某些細(xì)胞器更新的一個(gè)分解代謝過程[13-15]。遭受饑餓、氧化應(yīng)激、低氧、高溫、損傷等外界刺激情況下，或細(xì)胞器的損壞、突變蛋白的積聚及微生物的侵襲等應(yīng)激時(shí)，可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生。自噬在維護(hù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要的生理作用。目前的研究認(rèn)為，自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有雙重作用：首先，當(dāng)腫瘤發(fā)生初期，細(xì)胞出現(xiàn)基因組與染色體損傷，自噬能夠維持基因組與染色體穩(wěn)定，抑制腫瘤發(fā)生；然而，當(dāng)腫瘤已經(jīng)發(fā)生，由于其增殖速度較快，導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)微環(huán)境中氧和營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)因子等相對(duì)缺乏，腫瘤細(xì)胞能夠通過自噬作用不斷適應(yīng)生長(zhǎng)微環(huán)境，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生，此時(shí)自噬能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。自噬功能涉及正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞存活、分化、代謝、免疫等相關(guān)生理功能，其中腫瘤細(xì)胞自噬與細(xì)胞免疫的關(guān)系越來(lái)越受到人們的關(guān)注。一方面，自噬能夠?qū)?nèi)源性抗原通過MHCⅡ類分子形式呈遞給CD4+細(xì)胞，參與免疫應(yīng)答；另一方面，自噬過程同樣能夠產(chǎn)生新的抗原物質(zhì)，這些物質(zhì)最終以MHCⅠ類分子形式呈遞給CD8+細(xì)胞，進(jìn)而參與免疫應(yīng)答。由于細(xì)胞自噬過程非常復(fù)雜，尤其在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，自噬與免疫細(xì)胞之間的關(guān)系鮮有報(bào)道，因此，本研究旨在探討兩種不同分型的神經(jīng)母細(xì)胞瘤中自噬與免疫細(xì)胞的一致性，從而初步探討其臨床意義[14]。

本研究結(jié)果提示，患兒的身體狀態(tài)評(píng)價(jià)顯示兩組患兒身體狀態(tài)評(píng)分情況未見顯著差異；該結(jié)果表明兩組患者的一般資料較為一致，提示兩組具有可比性。兩組樣本中CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD4+、NK細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞水平顯示UH組顯著低于FH組，說明UH組機(jī)體免疫功能相對(duì)于FH組明顯降低。既往研究表明，嵌合抗原受體利用基因工程將能夠與腫瘤抗原結(jié)合的受體與跨細(xì)胞膜的部分和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的部分結(jié)合起來(lái)形成的一種新型受體，它可脫離主要組織相容性復(fù)合體的限制單獨(dú)執(zhí)行殺傷細(xì)胞的功能[15]。因此，可以結(jié)合本文結(jié)果采用嵌合抗原受體激活的方法，鏈?zhǔn)郊せ顧C(jī)體的免疫功能，達(dá)到免疫治療的目的，符合預(yù)期。CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD4+、NK細(xì)胞能夠特異性識(shí)別MHC類分子，從而實(shí)現(xiàn)抗原識(shí)別與腫瘤殺傷功能；B淋巴細(xì)胞能夠識(shí)別抗原的B細(xì)胞表位，發(fā)揮體液免疫功能。既往研究認(rèn)為，p62由原癌基因C-Myc編碼，它是一種泛素結(jié)合蛋白，與蛋白質(zhì)的泛素化密切相關(guān)，p62 參與多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控和自噬[16-18]；Beclin-1基因是Atg6/Vps30的哺乳動(dòng)物同源基因，是介導(dǎo)其他自噬蛋白定位于前自噬泡的關(guān)鍵因子，能調(diào)控哺乳動(dòng)物自噬體的形成與成熟；LC3-Ⅱ具有融合性質(zhì)，能促進(jìn)前自噬泡的延展。Western blot結(jié)果顯示，UH組LC3、Beclin-1和 p62蛋白表達(dá)水平顯著低于FH組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由該結(jié)果可以看出UH組NB細(xì)胞的自噬能力相對(duì)減弱，出現(xiàn)該結(jié)果的可能原因是與NB細(xì)胞凋亡水平降低有關(guān)。兩組樣本中一致性分析結(jié)果顯示，F(xiàn)H組中自噬分子表達(dá)水平與免疫細(xì)胞水平具有顯著一致性；而在UH中自噬分子表達(dá)水平與免疫細(xì)胞水平不具有顯著一致性，該結(jié)果與上述結(jié)果共同說明FH組自噬能力強(qiáng)，免疫功能強(qiáng)，腫瘤耐受水平弱；而UH組自噬能力弱，免疫功能弱，腫瘤耐受水平強(qiáng)。

綜上所述，不同組織類型的小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤的自噬活性不同，免疫細(xì)胞水平存在差異，且不同的組織類型與免疫細(xì)胞水平存在一定的關(guān)系，可能為NB的腫瘤耐受的潛在機(jī)制，但仍需進(jìn)一步研究的證實(shí)，目前國(guó)內(nèi)有研究神經(jīng)母細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)抑制可能與基因調(diào)控有關(guān)[19]。本研究分析了在不同分型的神經(jīng)母細(xì)胞瘤中自噬活性與免疫水平的相關(guān)性，并提出了一種可能的通過干預(yù)機(jī)體免疫功能從而治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤的方法；然而，本研究尚缺乏對(duì)免疫細(xì)胞作用機(jī)制研究，以及這些細(xì)胞變化的具體亞群的深入研究，今后將對(duì)這些工作進(jìn)行進(jìn)一步補(bǔ)充，以期為免疫療法治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤提供更加詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。