劉純宏 王 艷 石 鳳 陸玉蘭 黃華佗 王春芳 韋葉生 藍(lán) 艷

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，百色533000)

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸且缺乏開放閱讀框的新型非編碼RNA[1]。最初，LncRNA被認(rèn)為是“基因垃圾”“暗物質(zhì)”或“假基因”，不具有生物學(xué)功能。最新研究表明，LncRNA在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞增值、分化及凋亡過程。生長(zhǎng)停滯特異性轉(zhuǎn)錄本5(growth arrest specific transcript 5,GAS5)最初被發(fā)現(xiàn)積聚于生長(zhǎng)停滯細(xì)胞中的LncRNA，位于人類染色體1q25.1，由12個(gè)外顯子構(gòu)成，可編碼10個(gè)C/D snoRNA，全長(zhǎng)651個(gè)核苷酸。最新研究表明，GAS5與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、哮喘、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎等免疫相關(guān)疾病的發(fā)生密切相關(guān)，提示GAS5可能是某些免疫炎癥疾病的防治靶標(biāo)或生物標(biāo)記物[2-5]。目前，關(guān)于GAS5基因rs6790A/G和rs1951625A/G遺傳多態(tài)性在廣西人群中分布特征的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究采用SNPscan技術(shù)對(duì)廣西健康人群LncRNA-GAS5基因rs6790A/G和rs1951625A/G位點(diǎn)進(jìn)行基因分型檢測(cè)，并分析其多態(tài)性與其他地區(qū)人群的分布差異，為闡明GAS5基因多態(tài)性在不同種族之間的分布特征及其與疾病的關(guān)系提供群體遺傳學(xué)參考。

1 資料與方法

1.1資料 隨機(jī)選取2017年5月～2018年9月我院健康體檢者289例，其中男性106例，女性183例，年齡19～76歲。血常規(guī)及生化指標(biāo)均在正常參考范圍內(nèi)，結(jié)合影像學(xué)檢查及臨床醫(yī)師診斷，排除自身免疫、神經(jīng)系統(tǒng)、腫瘤、肝臟、腎臟、心臟等疾病；研究對(duì)象均為世居于廣西地區(qū)且相互間無(wú)血緣關(guān)系的個(gè)體。本研究方案獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者知情同意。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 用EDTA-K2抗凝管采集各受試者靜脈血3.0 ml，采用離心柱法提取基因組DNA，-70 ℃保存?zhèn)溆?。連接引物的設(shè)計(jì)與合成從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中查找LncRNA GAS5基因rs6790A/G和rs1951625A/G位點(diǎn)的堿基序列，采用primer3在線軟件(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)輔助設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)引物序列(表1)，委托上海天昊生物科技有限公司合成。

1.2.2連接和多重PCR反應(yīng)及基因分型檢測(cè) 連接反應(yīng)體系總體積為20.0 μl，其中含樣本DNA 8.0 μl、2× 連接緩沖液 10.0 μl、耐熱DNA連接酶0.2 μl、連接探針混合液0.8 μl、 剩余體積用滅菌雙

表1 GAS5基因rs6790A/G和rs1951625A/G引物序列

蒸水補(bǔ)足。連接反應(yīng)參數(shù)：98℃ 2 min；95℃ 30 s，58℃ 3 h；循環(huán)5次；94℃ 2 min；72℃ forever。將連接產(chǎn)物進(jìn)行多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增，多重PCR反應(yīng)體系的總體積為20.0 μl，其中包含連接產(chǎn)物1.0 μl，2×PCR緩沖液A 10.0 μl，TaqDNA聚合酶0.4 μl，多重?zé)晒鈹U(kuò)增引物0.5 μl，滅菌雙蒸水8.1 μl。多重PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃ 2 min；94℃ 20 s，62℃ 40 s(每個(gè)循環(huán)降低0.5℃)，72℃ 1.5 min，循環(huán)9次；94℃ 20 s，57℃ 40 s，72℃ 1.5 min，循環(huán)25次；68℃ 60 min；4℃ forever。將多重PCR產(chǎn)物以10倍ddH2O稀釋，振蕩混勻，取1.0 μl PCR產(chǎn)物與 0.1 μl LIZ500和8.9 μl Hi-Di混勻，95℃變性 5 min，后ABI3500測(cè)序儀檢測(cè)，采用GeneMapper 4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)樣本的群體代表性。基因型和等位基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算，不同組間基因型和等位基因頻率的比較用行χ2檢驗(yàn)和四格表χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1廣西人群GAS5基因rs6790A/G和rs19516 25A/G分型檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果顯示，rs6790A/G位點(diǎn)存在AA、AG和GG 3種基因型，頻率分別為15.6%、48.1%和36.3%，A、G等位基因頻率分別為39.6%和60.4%。rs1951625A/G位點(diǎn)存在AA、AG和GG 3種基因型，頻率分別為8.3%、38.1%和53.6%，A、G等位基因頻率分別為27.3%和72.7%。2個(gè)位點(diǎn)的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)，表明本研究所選取的人群具有群體代表性?；蚍中蜋z測(cè)結(jié)果見圖1。

2.2rs6790A/G和rs1951625A/G位點(diǎn)多態(tài)性在廣西人群不同性別間的分布 廣西人群GAS5基因rs6790A/G和rs1951625A/G位點(diǎn)分別以AG和GG基因型為多見，其頻率分別為48.1%和53.6%；G等位基因頻率最高，分別為60.4%和72.7%。2位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在男性和女性間的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示2個(gè)位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在廣西人群中的分布與性別無(wú)關(guān)，見表2。

2.3廣西人群rs6790A/G和rs1951625A/G多態(tài)性與其他地區(qū)人群比較 將廣西人群rs6790A/G和rs1951625A/G位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分別與國(guó)際千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)公布的CHS、JPT、CEU、AFR和AMR人群進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，廣西人群rs6790A/G位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與JPT、CEU、ARF和AMR人群比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與CHS人群比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；廣西人群rs1951625A/G位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與AFR人群比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與CHS、JPT、CEU和AMR人群比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見表3、4。

表2 rs6790A/G和rs1951625A/G位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在廣西人群不同性別間比較[例(%)]

表3 廣西人群GAS5基因rs6790A/G遺傳多態(tài)性與不同人群的比較[例(%)]

表4 廣西人群GAS5基因rs1951625A/G遺傳多態(tài)性與不同人群的比較[例(%)]

3 討論

LncRNA-GAS5最初被發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯密切相關(guān)，全長(zhǎng)651個(gè)核苷酸，其編碼基因GAS5屬于5′-top家族成員，其外顯子不具有編碼能力，而內(nèi)含子可編碼10box C/D的miRNAs并發(fā)揮生物學(xué)作用[6]。GAS5第400～598個(gè)核苷酸含有6對(duì)短發(fā)夾結(jié)構(gòu)，且第5對(duì)發(fā)夾結(jié)構(gòu)含有2條糖皮質(zhì)激素受體反應(yīng)元件 (glucocorticoid receptor response element，GRE) 序列，稱為GAS5 GRE-mimic[7]。由于GAS5具有相對(duì)復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可能是其具有復(fù)雜生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。近年GAS5基因與疾病的關(guān)系引起研究者關(guān)注，成為基因研究的新興領(lǐng)域。Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn)GAS5基因啟動(dòng)子區(qū)的rs55829688位點(diǎn)突變與結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)，并通過影響轉(zhuǎn)錄因子YY1與GAS5的結(jié)合親和力降低GAS5表達(dá)。Tang等[8]研究發(fā)現(xiàn)GAS5基因rs145204276位點(diǎn)del等位基因可能通過與轉(zhuǎn)錄因子特異性蛋白1結(jié)合，誘導(dǎo)啟動(dòng)子活性，從而抑制乳腺癌發(fā)生，導(dǎo)致GAS5水平升高。伊朗學(xué)者Rakhshan等[9]研究發(fā)現(xiàn)GAS5基因rs2067079位點(diǎn)隱性遺傳模型(TT vs.CC + CT)及rs2067079和rs6790位點(diǎn)單倍型組合T-G可能增加膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

遺傳多態(tài)性可因自然選擇、環(huán)境因素、飲食習(xí)慣和不同種族呈現(xiàn)不同程度的差異，現(xiàn)有研究表明，不同遺傳背景的人群對(duì)相同疾病易感性不同。如埃及學(xué)者Shaker等[10]研究發(fā)現(xiàn)LncRNA-CASC8基因rs6983267位點(diǎn)多態(tài)性可能提高大腸癌遺傳易感性(GG vs.GT/TT：OR=2.13，95%CI=1.146～3.937，P=0.017)；而西班牙學(xué)者Carla等[11]研究發(fā)現(xiàn)rs6983267位點(diǎn)多態(tài)性可能降低大腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(GG vs.GT/TT：OR=0.69，95%CI=0.50～0.95，P<0.001)。出現(xiàn)此差異性結(jié)果的原因可能是研究對(duì)象遺傳背景不同。因此，研究不同地區(qū)和族群間正常人群的基因多態(tài)性分布特征，可闡明不同地區(qū)人群的遺傳背景資料，也為進(jìn)一步研究不同人群基因多態(tài)性與某些疾病的遺傳易感性提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

本研究采用SNPscan測(cè)序技術(shù)檢測(cè)廣西人群LncRNA-GAS5基因rs6790A/G和rs1951625A/G位點(diǎn)多態(tài)性，結(jié)果顯示，廣西人群GAS5基因rs6790A/G和rs1951625A/G位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布在不同性別間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示GAS5基因rs6790A/G和rs1951625A/G位點(diǎn)在廣西人群中的遺傳多態(tài)性分布與性別無(wú)關(guān)。進(jìn)一步將廣西人群rs6790A/G和rs1951625A/G位點(diǎn)多態(tài)性與千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)公布的CHS、JPT、CEU、AFR和AMR人群的SNP分型數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)廣西人群rs6790A/G位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與JPT、CEU、ARF和AMR人群比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與CHS人群比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；廣西人群rs1951625A/G位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與AFR人群比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與CHS、JPT、CEU和AMR人群比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究已證實(shí)基因多態(tài)性與地緣關(guān)系、生活習(xí)性及種族等多種因素密切相關(guān)，與本研究結(jié)果相符[12-14]。廣西人群與CHS和JPT人群同屬于亞洲人群，地緣關(guān)系相對(duì)較近，因此，這3種人群的遺傳多態(tài)性分布差異相對(duì)較小，與“親緣關(guān)系越近，其基因型的分布越相似，反之則差異越顯著”的遺傳學(xué)定律相符。與此同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)JPT人群與廣西地區(qū)人群雖然都是亞洲人群，但由于廣西是多民族聚集的偏遠(yuǎn)山區(qū)，地理環(huán)境及氣候獨(dú)特，生活方式及飲食習(xí)慣與其他地區(qū)也存在較大差異，因此，2種人群的遺傳多態(tài)性也呈現(xiàn)差異性。而廣西人群與CEU、AFR和AMR人群屬于不同種族人群，3者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，地理及生態(tài)隔離阻礙了種族間遺傳物質(zhì)的交流，隨著時(shí)間積累，各隔離群體發(fā)生的遺傳變異朝著不同的方向發(fā)展，可能是造成3種人群存在較明顯的遺傳多態(tài)性差異的原因之一。rs1951625A/G位點(diǎn)多態(tài)性與AFR人群差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與CHS、JPT、CEU和AMR人群差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的原因之一可能與“人類起源學(xué)說(shuō)”有關(guān)，研究認(rèn)為人類在非洲具有1個(gè)共同祖先，而隨著氣候、地理等因素人類逐漸走出非洲，到達(dá)世界各地[15]?，F(xiàn)代人類經(jīng)過漫長(zhǎng)的遷移，與不同地區(qū)原有的近緣同類混血通婚，并獨(dú)立進(jìn)化，形成不同族群，隨著時(shí)間的積累，不同群體與非洲人群間的差異越來(lái)越明顯。因此，本研究認(rèn)為出現(xiàn)此差異結(jié)果的原因可能與人類歷史上大規(guī)模的遷徙、自然的選擇及基因的隨機(jī)漂變有關(guān)。提示廣西人群存在GAS5基因多態(tài)性，且與其他地區(qū)人群比較存在不同程度的差異。

本研究初步探討了廣西人群GAS5基因rs6790A/G和rs1951625A/G位點(diǎn)多態(tài)性分布特征，并與國(guó)際千人基因組計(jì)劃公布的不同地區(qū)人群的SNP分型數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較，不僅為GAS5基因多態(tài)性的群體遺傳學(xué)普查提供了數(shù)據(jù)資料，同時(shí)也為其與相關(guān)疾病易感性的研究奠定了遺傳學(xué)基礎(chǔ)。但廣西是多民族聚集區(qū)，本研究未能具體到民族，有待進(jìn)一步研究。