羅 清 黃自坤 張 露 李俊明

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，南昌330006)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)作為常見的自身免疫性疾病，嚴(yán)重危害人類健康，其因機(jī)體免疫功能紊亂而產(chǎn)生抗雙鏈DNA抗體(anti-double-stranded DNA antibody，anti-dsDNA)、抗Sm抗體(anti-Smith antibody，anti-Sm)等多種自身抗體，造成多個組織、器官損傷，進(jìn)而出現(xiàn)多樣化的臨床表現(xiàn)[1]。臨床研究證實，雖然目前出現(xiàn)新型的生物制劑和更有效的SLE治療策略，但其緩解率仍不高，造成這種狀況的原因之一是缺乏高度敏感、特異的SLE診斷方法，疾病進(jìn)程監(jiān)測以及治療評價的方法。環(huán)狀RNA是新發(fā)現(xiàn)的由外顯子、內(nèi)含子或兩者的轉(zhuǎn)錄本形成的閉合環(huán)，能夠耐受核酸外切酶的消化，具有良好的生物穩(wěn)定性，且廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)外[2]。這些特點使得環(huán)狀RNA作為新型臨床生物標(biāo)記物成為各種疾病研究領(lǐng)域的新熱點[3]。并且已有大量研究證實環(huán)狀RNA可用于多種疾病的診斷、療效判斷、監(jiān)測復(fù)發(fā)等[4-6]。而其在SLE中的所呈現(xiàn)的診斷效能和致病作用也逐漸被大家所認(rèn)識[7,8]。在本課題組的前期研究工作中，通過采用高通量基因芯片篩查發(fā)現(xiàn)SLE患者全血中環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表達(dá)顯著升高，提示其可能作為SLE診斷標(biāo)志物。因此，本研究旨在檢測SLE患者全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626的表達(dá)水平，探討hsa_circ_0004156、hsa_circ_0082626以及聯(lián)合這兩種環(huán)狀RNA在SLE診斷和鑒別診斷中的作用。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 SLE疾病組來自于2018年9月至2019年2月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科確診的47例初診未用藥SLE患者，其中男性5例，女性42例，平均年齡(6.42±16.68)歲，SLE的診斷依據(jù)按照美國風(fēng)濕病學(xué)會(American College of Rheumatology，ACR)1997年修訂的分類標(biāo)準(zhǔn)[9]，并除外其他嚴(yán)重疾病。正常對照組(healthy controls，HC)來自于同時期南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康志愿者32例，其中男性4例，女性28例，平均年齡(42.59±13.51)歲。SLE疾病組與正常對照組年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義。RA疾病對照組來自于2018年9月至2019年2月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科確診的37例初診未用藥類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)患者，其中男性6例，女性31例，平均年齡(49.81±12.78)歲，RA的診斷依據(jù)按照ACR 1987年修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除其他嚴(yán)重疾病[10]。

1.1.2主要試劑、儀器 Trizol試劑購自Invitrogen 公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 和 SYBR?Premix Ex TaqTM購自大連寶生物 TaKaRa公司；hsa_circ_0004156 、hsa_circ_0082626及內(nèi)參基因 β-actin 引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Nanodrop ND-1000 紫外分光光度計購自美國 Nanodrop 公司；Applied Biosystems 7500 型熒光定量 PCR儀器購自美國 ABI 公司。

1.2方法

1.2.1全血總RNA提取及cDNA合成 采集SLE患者、RA疾病對照者和正常對照者空腹乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝靜脈血2 ml，6 h內(nèi)取250 ml全血加用750 ml Trizol試劑處理，放-80℃冰箱保存。按 Trizol 試劑說明書推薦的標(biāo)準(zhǔn)流程提取所有受試者全血的總RNA，焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)處理過的蒸餾水溶解 RNA。取1 ml提取的總RNA，按照說明書利用 PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.2實時熒光定量聚合酶連反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR) 采用TaKaRa實時熒光定量PCR SYBR Green法，按照試劑盒說明書提供的檢測步驟、反應(yīng)體系、反應(yīng)條件進(jìn)行。以β-actin基因作為內(nèi)參，采用ABI7500儀器進(jìn)行環(huán)狀RNA水平的檢測，通過熔解曲線檢測環(huán)狀RNA PCR產(chǎn)物中有無非特異性擴(kuò)增。根據(jù)待測標(biāo)本的Ct值，采用相對定量法對RT-PCR結(jié)果進(jìn)行分析，計算2-ΔΔCt[11]。ΔCt(疾病組)= Ct(疾病組目的環(huán)狀RNA)-Ct(疾病組β-actin內(nèi)參基因)，ΔCt(對照組)=Ct(對照組目的環(huán)狀RNA)-Ct(對照組β-actin內(nèi)參基因)，ΔΔCt = ΔCt(疾病組)-ΔCt(對照組)。引物序列見表1。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析均使用SPSS17.0軟件進(jìn)行。正態(tài)分布數(shù)據(jù)使用采用t檢驗，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗。環(huán)狀RNA與SLE實驗室指標(biāo)的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析。環(huán)狀RNA對于SLE診斷及鑒別診斷價值的評價采用受試者工作特征(receiver-operator characteristic,ROC)曲線。以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1比較不同分組全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表達(dá)水平 采用RT-qPCR檢測全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626在HC、SLE疾病組和RA疾病對照組中的表達(dá)水平結(jié)果表明：全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156在SLE疾病組的表達(dá)水平明顯高于HC和RA疾病對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(U=410.5，P<0.001；t=3.2，P=0.002；圖1A)；全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0082626在SLE疾病組的表達(dá)水平明顯高于HC和RA疾病對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(U=426.0，P=0.001；U=337.0，P<0.001；圖1B)。

表1 RT-qPCR引物序列

2.2全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表達(dá)與SLE實驗室指標(biāo)的關(guān)系 SLE患者常用的實驗室指標(biāo)包括血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)、補(bǔ)體3(complement 3，C3)、補(bǔ)體4(complement 4，C4)、抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)、anti-dsDNA、抗nRNP/Sm抗體(anti-nuclear ribonucl-eoprotein/Smith antibody，anti-nRNP/Sm)、anti-Sm、抗核小體抗體(anti-nucleosome antibody，AnuA)、抗核糖體P蛋白抗體(anti-ribosome RNP antibody，anti-rRNP)、抗SS-A抗體(anti-sj?gren syndrome A antigen antibody，anti-SS-A)、抗SS-B抗體(anti-sj?gren syndrome B antigen antibody，anti-SS-B)，抗Ro52抗體(anti-Ro52 antibody，anti-Ro52)、抗組蛋白抗體(anti-histone antibody，AHA)，分析這些實驗室指標(biāo)與全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156、hsa_circ_0082626表達(dá)水平的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，如表2所示，SLE疾病組全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156表達(dá)水平與C3(rs=-0.333,P=0.029)呈負(fù)相關(guān)，與anti-Sm(rs=0.305,P=0.049)、 AHA(rs=0.309,P=0.047)

圖1 SLE患者和對照組全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156、hsa_circ_0082626表達(dá)水平的比較Fig.1 Expression of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 and hsa_circ_0082626 in SLE patients and controlsNote:A.The expression of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 was significantly increased in SLE patients than that in RA patients and HC；B.The expression of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0082626 was significantly increased in SLE patients than that in RA patients and HC.

呈正相關(guān)；SLE疾病組全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0082626表達(dá)水平與C4(rs=-0.340,P=0.026)呈負(fù)相關(guān)，與AnuA(rs=0.313,P=0.044)呈正相關(guān)。此外本研究還發(fā)現(xiàn)，anti-Sm陽性的SLE疾病組的全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156表達(dá)水平明顯高于anti-Sm陰性SLE疾病組(t=2.4，P=0.023)，anti-dsDNA間接免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法陽性SLE疾病組的全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0082626表達(dá)水平分別明顯高于anti-dsDNA間接免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法陰性SLE疾病組(U=148.5，P=0.030；U=144.5，P=0.023)，C4降低的SLE疾病組的全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0082626表達(dá)水平分別明顯高于C4正常SLE疾病組(U=105.5，P=0.030)，如表3所示。但未發(fā)現(xiàn)全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156、hsa_circ_0082626表達(dá)水平與SLE的其他實驗室指標(biāo)相關(guān)。

2.3全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表達(dá)與SLE臨床表現(xiàn)的關(guān)系 SLE臨床表現(xiàn)復(fù)雜、多樣，分析SLE臨床表現(xiàn)以及SLE疾病活動性評分(SLE disease activity index，SLEDAI)與全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表達(dá)水平的關(guān)系表明(圖2)，SLE疾病組全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156表達(dá)水平與心包炎(t=2.4，P=0.020)、貧血(t=2.0，P=0.049)、低白細(xì)胞血癥(t=2.5，P=0.018)相關(guān)，SLE疾病組全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0082626表達(dá)水平與低血小板血癥相關(guān)(U=119.5，P=0.050)。但并未發(fā)現(xiàn)全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表達(dá)水平與SLE的其他臨床表現(xiàn)以及SLEDAI相關(guān)。

2.4全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626對SLE診斷價值 為了評估全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626對SLE診斷價值，本文繪制了SLE疾病組區(qū)別于HC和RA疾病對照組的ROC曲線，結(jié)果如圖3所示，SLE疾病組全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156在用于區(qū)別HC和RA疾病對照組的AUC分別為0.727(圖3A)和0.750(圖3B)，SLE疾病組全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0082626在用于區(qū)別HC和RA疾病對照組的AUC分別為0.717(圖3C)和0.806(圖3D)。以1.532為截斷值，全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156診斷SLE疾病組與HC的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和約登指數(shù)分別為51.06%、87.50%、85.71%、54.90%、0.386；以1.039為截斷值，全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156鑒別SLE疾病組與RA疾病對照組的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和約登指數(shù)分別為72.34%、70.27%、75.56%、66.67%、0.426；以1.867為截斷值，全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0082626診斷SLE疾病組與HC的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和約登指數(shù)分別為63.83%、81.25%、83.33%、60.47%、0.451；以1.387為截斷值，全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0082626鑒別SLE疾病組與RA疾病對照組的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和約登指數(shù)分別為72.34%、83.78%、85.00%、70.45%、0.561。

表2 SLE患者全血環(huán)狀RNA與實驗室指標(biāo)的相關(guān)性分析

表3 SLE患者全血環(huán)狀RNA與實驗室指標(biāo)的關(guān)系

圖2 全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表達(dá)與SLE臨床表現(xiàn)的關(guān)系Fig.2 Correlation of expression of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 and hsa_circ_0082626 in SLE patients with clinical manifestationNote:A.The expression of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 in SLE patients with clinical manifestation;B.The expression of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0082626 in SLE patients with clinical manifestation.Compared to the negative group,*.P<0.05,#.P=0.05.

圖3 全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626的ROC曲線分析Fig.3 ROC curve analysis of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 and hsa_circ_0082626 Note:A.The ROC curve analysis of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 in SLE patients and HC;B.The ROC curve analysis of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 in SLE patients and RA patients;C.The ROC curve analysis of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0082626 in SLE patients and HC;D.The ROC curve analysis of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0082626 in SLE patients and RA patients.

圖4 聯(lián)合全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626的ROC曲線分析Fig.4 ROC curve analysis of combined peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 and hsa_circ_0082626Note:A.The ROC curve analysis of combined peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 and hsa_circ_0082626 in SLE patients and HC;B.The ROC curve analysis of combined peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 and hsa_circ_0082626 in SLE patients and RA patients.

2.5聯(lián)合全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626對SLE診斷價值 聯(lián)合全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626對SLE診斷價值分析發(fā)現(xiàn)，SLE疾病組聯(lián)合全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156-hsa_circ_0082626在用于區(qū)別HC和RA疾病對照組的AUC分別為0.757(圖4A)和0.815(圖4B)，均高于單項環(huán)狀RNA的AUC。聯(lián)合全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156-hsa_circ_0082626診斷SLE疾病組與HC的敏感度和特異度分別為72.34%和71.88%；聯(lián)合全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156-hsa_circ_0082626鑒別SLE疾病組與RA疾病對照組的敏感度和特異度分別為72.34%和83.78%。

3 討論

環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156位于4號染色體，即4號染色體1902352-1920350(正鏈)，被 RNA 轉(zhuǎn)錄酶 Ⅱ 轉(zhuǎn)錄，其轉(zhuǎn)錄本有1439 nt[12]。環(huán)狀RNA hsa_circ_0082626位于7號染色體，即7號染色體138758601-138774505(負(fù)鏈)，被 RNA 轉(zhuǎn)錄酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，其轉(zhuǎn)錄本有1564 nt[13]。目前尚未見有關(guān)環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626的研究報道。本課題組前期采用高通量基因芯片篩查發(fā)現(xiàn)SLE患者全血中環(huán)狀RNA表達(dá)譜發(fā)生了一些變化。本研究中，以變化顯著的環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626為研究對象，探討環(huán)狀RNA RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626在SLE全血中的表達(dá)水平及其意義。

結(jié)果顯示，相比于RA疾病對照組及正常對照組，SLE疾病組全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626的表達(dá)量顯著上調(diào)。ROC曲線分析環(huán)狀RNA 的診斷價值發(fā)現(xiàn)，全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626的AUC分別為0.727(敏感度為51.06%，特異度為87.50%)和0.717(敏感度為63.83%，特異度為81.25%)，而兩者聯(lián)合診斷的AUC更高，可達(dá)到0.757(敏感度為72.34%，特異度為71.88%)，提示全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626可能作為診斷SLE的潛在有效標(biāo)識。進(jìn)一步采用ROC曲線分析環(huán)狀RNA是否能將RA患者中鑒別診斷SLE患者發(fā)現(xiàn)，全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626的AUC分別為0.750(敏感度為72.34%，特異度為70.27%)和0.806(敏感度為72.34%，特異度為83.78%)，而兩者聯(lián)合診斷的AUC更高，可達(dá)到0.815(敏感度為72.34%，特異度為83.78%)，提示全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626可能用于SLE與RA的鑒別診斷。

越來越多的研究證實環(huán)狀RNA不僅可以作為SLE的診斷標(biāo)志物，而且可用于評估疾病的嚴(yán)重程度。比如，Miao等[14]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)的circPTPN22與SLE的疾病活動性評分呈負(fù)相關(guān)，且經(jīng)治療SLE病情緩解后其circPTPN22的表達(dá)水平可明顯上調(diào)；Li等[15]證實兒童SLE患者全血中的hsa_circ_0021372 和 hsa_circ_0075699與SLE患者的C3/C4疾病活動性指標(biāo)相關(guān)；此外，Ouyang等[16]研究結(jié)果表明血漿circRNA_002453不但可以作為狼瘡腎的新型診斷標(biāo)志物，而且可作為狼瘡腎嚴(yán)重程度的評價指標(biāo)。本文研究也發(fā)現(xiàn)全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表達(dá)水平分別與C3和C4呈負(fù)相關(guān)，還發(fā)現(xiàn)全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表達(dá)水平與自身抗體的產(chǎn)生密切相關(guān)。進(jìn)一步分析SLE患者環(huán)狀RNA與SLE臨床表現(xiàn)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0004156表達(dá)水平與SLE患者心包炎、貧血、低白細(xì)胞血癥相關(guān)，而hsa_circ_0082626表達(dá)水平與SLE患者低血小板血癥相關(guān)。這些結(jié)果證實了SLE患者全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表達(dá)水平與疾病的活動度和嚴(yán)重程度密切相關(guān)，其不僅可能作為SLE診斷及鑒別診斷指標(biāo)，還可作為評估SLE疾病嚴(yán)重程度和活動度的指標(biāo)。

需要指出的是，本文還存在一些不足：①SLE患者病例數(shù)較少，尤其是并發(fā)心包炎、貧血、低白細(xì)胞血癥、低血小板血癥的患者。雖然采用合適的統(tǒng)計學(xué)方法得出上述臨床表現(xiàn)與全血環(huán)狀RNAhsa_circ_0004156、hsa_circ_0082626相關(guān)，但后續(xù)應(yīng)該擴(kuò)大SLE患者樣本量，尤其是并發(fā)上述癥狀的SLE患者，進(jìn)一步證實SLE患者全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表達(dá)水平與這些臨床表現(xiàn)的關(guān)系。②由于缺乏對照組的自身抗體、C3、C4等數(shù)據(jù)，未聯(lián)合評價環(huán)狀RNA+自身抗體/C3/C4對SLE的診斷價值。

綜上，SLE患者全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626明顯升高，且與疾病活動性、自身抗體產(chǎn)生以及臨床癥狀密切相關(guān)，可能作為SLE的潛在診斷及鑒別診斷標(biāo)志物，同時可作為評估疾病嚴(yán)重程度和活動性的指標(biāo)。但hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626如何調(diào)控SLE發(fā)病尚不清楚，希望通過更多的研究來探討hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626在SLE中所呈現(xiàn)的致病作用。