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        環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者全血中的表達及臨床意義①

        2020-12-25 00:31:20黃自坤李俊明
        中國免疫學雜志 2020年20期
        關鍵詞:環(huán)狀全血敏感度

        羅 清 黃自坤 張 露 李俊明

        (南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科,南昌330006)

        系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)作為常見的自身免疫性疾病,嚴重危害人類健康,其因機體免疫功能紊亂而產生抗雙鏈DNA抗體(anti-double-stranded DNA antibody,anti-dsDNA)、抗Sm抗體(anti-Smith antibody,anti-Sm)等多種自身抗體,造成多個組織、器官損傷,進而出現多樣化的臨床表現[1]。臨床研究證實,雖然目前出現新型的生物制劑和更有效的SLE治療策略,但其緩解率仍不高,造成這種狀況的原因之一是缺乏高度敏感、特異的SLE診斷方法,疾病進程監(jiān)測以及治療評價的方法。環(huán)狀RNA是新發(fā)現的由外顯子、內含子或兩者的轉錄本形成的閉合環(huán),能夠耐受核酸外切酶的消化,具有良好的生物穩(wěn)定性,且廣泛存在于細胞內外[2]。這些特點使得環(huán)狀RNA作為新型臨床生物標記物成為各種疾病研究領域的新熱點[3]。并且已有大量研究證實環(huán)狀RNA可用于多種疾病的診斷、療效判斷、監(jiān)測復發(fā)等[4-6]。而其在SLE中的所呈現的診斷效能和致病作用也逐漸被大家所認識[7,8]。在本課題組的前期研究工作中,通過采用高通量基因芯片篩查發(fā)現SLE患者全血中環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表達顯著升高,提示其可能作為SLE診斷標志物。因此,本研究旨在檢測SLE患者全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626的表達水平,探討hsa_circ_0004156、hsa_circ_0082626以及聯合這兩種環(huán)狀RNA在SLE診斷和鑒別診斷中的作用。

        1 資料與方法

        1.1資料

        1.1.1臨床資料 SLE疾病組來自于2018年9月至2019年2月在南昌大學第一附屬醫(yī)院風濕免疫科確診的47例初診未用藥SLE患者,其中男性5例,女性42例,平均年齡(6.42±16.68)歲,SLE的診斷依據按照美國風濕病學會(American College of Rheumatology,ACR)1997年修訂的分類標準[9],并除外其他嚴重疾病。正常對照組(healthy controls,HC)來自于同時期南昌大學第一附屬醫(yī)院進行體檢的健康志愿者32例,其中男性4例,女性28例,平均年齡(42.59±13.51)歲。SLE疾病組與正常對照組年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義。RA疾病對照組來自于2018年9月至2019年2月在南昌大學第一附屬醫(yī)院風濕免疫科確診的37例初診未用藥類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)患者,其中男性6例,女性31例,平均年齡(49.81±12.78)歲,RA的診斷依據按照ACR 1987年修訂的RA診斷標準,并排除其他嚴重疾病[10]。

        1.1.2主要試劑、儀器 Trizol試劑購自Invitrogen 公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 和 SYBR?Premix Ex TaqTM購自大連寶生物 TaKaRa公司;hsa_circ_0004156 、hsa_circ_0082626及內參基因 β-actin 引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;Nanodrop ND-1000 紫外分光光度計購自美國 Nanodrop 公司;Applied Biosystems 7500 型熒光定量 PCR儀器購自美國 ABI 公司。

        1.2方法

        1.2.1全血總RNA提取及cDNA合成 采集SLE患者、RA疾病對照者和正常對照者空腹乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝靜脈血2 ml,6 h內取250 ml全血加用750 ml Trizol試劑處理,放-80℃冰箱保存。按 Trizol 試劑說明書推薦的標準流程提取所有受試者全血的總RNA,焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)處理過的蒸餾水溶解 RNA。取1 ml提取的總RNA,按照說明書利用 PrimeScript反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。

        1.2.2實時熒光定量聚合酶連反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR) 采用TaKaRa實時熒光定量PCR SYBR Green法,按照試劑盒說明書提供的檢測步驟、反應體系、反應條件進行。以β-actin基因作為內參,采用ABI7500儀器進行環(huán)狀RNA水平的檢測,通過熔解曲線檢測環(huán)狀RNA PCR產物中有無非特異性擴增。根據待測標本的Ct值,采用相對定量法對RT-PCR結果進行分析,計算2-ΔΔCt[11]。ΔCt(疾病組)= Ct(疾病組目的環(huán)狀RNA)-Ct(疾病組β-actin內參基因),ΔCt(對照組)=Ct(對照組目的環(huán)狀RNA)-Ct(對照組β-actin內參基因),ΔΔCt = ΔCt(疾病組)-ΔCt(對照組)。引物序列見表1。

        1.3統(tǒng)計學分析 數據分析均使用SPSS17.0軟件進行。正態(tài)分布數據使用采用t檢驗,非正態(tài)分布數據采用非參數檢驗。環(huán)狀RNA與SLE實驗室指標的關系采用Spearman相關分析。環(huán)狀RNA對于SLE診斷及鑒別診斷價值的評價采用受試者工作特征(receiver-operator characteristic,ROC)曲線。以雙側P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1比較不同分組全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表達水平 采用RT-qPCR檢測全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626在HC、SLE疾病組和RA疾病對照組中的表達水平結果表明:全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156在SLE疾病組的表達水平明顯高于HC和RA疾病對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(U=410.5,P<0.001;t=3.2,P=0.002;圖1A);全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0082626在SLE疾病組的表達水平明顯高于HC和RA疾病對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(U=426.0,P=0.001;U=337.0,P<0.001;圖1B)。

        表1 RT-qPCR引物序列

        2.2全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表達與SLE實驗室指標的關系 SLE患者常用的實驗室指標包括血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C-反應蛋白(C-reactive protein,CRP)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)、補體3(complement 3,C3)、補體4(complement 4,C4)、抗核抗體(antinuclear antibody,ANA)、anti-dsDNA、抗nRNP/Sm抗體(anti-nuclear ribonucl-eoprotein/Smith antibody,anti-nRNP/Sm)、anti-Sm、抗核小體抗體(anti-nucleosome antibody,AnuA)、抗核糖體P蛋白抗體(anti-ribosome RNP antibody,anti-rRNP)、抗SS-A抗體(anti-sj?gren syndrome A antigen antibody,anti-SS-A)、抗SS-B抗體(anti-sj?gren syndrome B antigen antibody,anti-SS-B),抗Ro52抗體(anti-Ro52 antibody,anti-Ro52)、抗組蛋白抗體(anti-histone antibody,AHA),分析這些實驗室指標與全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156、hsa_circ_0082626表達水平的相關性發(fā)現,如表2所示,SLE疾病組全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156表達水平與C3(rs=-0.333,P=0.029)呈負相關,與anti-Sm(rs=0.305,P=0.049)、 AHA(rs=0.309,P=0.047)

        圖1 SLE患者和對照組全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156、hsa_circ_0082626表達水平的比較Fig.1 Expression of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 and hsa_circ_0082626 in SLE patients and controlsNote:A.The expression of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 was significantly increased in SLE patients than that in RA patients and HC;B.The expression of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0082626 was significantly increased in SLE patients than that in RA patients and HC.

        呈正相關;SLE疾病組全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0082626表達水平與C4(rs=-0.340,P=0.026)呈負相關,與AnuA(rs=0.313,P=0.044)呈正相關。此外本研究還發(fā)現,anti-Sm陽性的SLE疾病組的全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156表達水平明顯高于anti-Sm陰性SLE疾病組(t=2.4,P=0.023),anti-dsDNA間接免疫熒光法、酶聯免疫吸附法陽性SLE疾病組的全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0082626表達水平分別明顯高于anti-dsDNA間接免疫熒光法、酶聯免疫吸附法陰性SLE疾病組(U=148.5,P=0.030;U=144.5,P=0.023),C4降低的SLE疾病組的全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0082626表達水平分別明顯高于C4正常SLE疾病組(U=105.5,P=0.030),如表3所示。但未發(fā)現全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156、hsa_circ_0082626表達水平與SLE的其他實驗室指標相關。

        2.3全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表達與SLE臨床表現的關系 SLE臨床表現復雜、多樣,分析SLE臨床表現以及SLE疾病活動性評分(SLE disease activity index,SLEDAI)與全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表達水平的關系表明(圖2),SLE疾病組全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156表達水平與心包炎(t=2.4,P=0.020)、貧血(t=2.0,P=0.049)、低白細胞血癥(t=2.5,P=0.018)相關,SLE疾病組全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0082626表達水平與低血小板血癥相關(U=119.5,P=0.050)。但并未發(fā)現全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表達水平與SLE的其他臨床表現以及SLEDAI相關。

        2.4全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626對SLE診斷價值 為了評估全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626對SLE診斷價值,本文繪制了SLE疾病組區(qū)別于HC和RA疾病對照組的ROC曲線,結果如圖3所示,SLE疾病組全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156在用于區(qū)別HC和RA疾病對照組的AUC分別為0.727(圖3A)和0.750(圖3B),SLE疾病組全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0082626在用于區(qū)別HC和RA疾病對照組的AUC分別為0.717(圖3C)和0.806(圖3D)。以1.532為截斷值,全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156診斷SLE疾病組與HC的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和約登指數分別為51.06%、87.50%、85.71%、54.90%、0.386;以1.039為截斷值,全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156鑒別SLE疾病組與RA疾病對照組的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和約登指數分別為72.34%、70.27%、75.56%、66.67%、0.426;以1.867為截斷值,全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0082626診斷SLE疾病組與HC的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和約登指數分別為63.83%、81.25%、83.33%、60.47%、0.451;以1.387為截斷值,全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0082626鑒別SLE疾病組與RA疾病對照組的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和約登指數分別為72.34%、83.78%、85.00%、70.45%、0.561。

        表2 SLE患者全血環(huán)狀RNA與實驗室指標的相關性分析

        表3 SLE患者全血環(huán)狀RNA與實驗室指標的關系

        圖2 全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表達與SLE臨床表現的關系Fig.2 Correlation of expression of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 and hsa_circ_0082626 in SLE patients with clinical manifestationNote:A.The expression of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 in SLE patients with clinical manifestation;B.The expression of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0082626 in SLE patients with clinical manifestation.Compared to the negative group,*.P<0.05,#.P=0.05.

        圖3 全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626的ROC曲線分析Fig.3 ROC curve analysis of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 and hsa_circ_0082626 Note:A.The ROC curve analysis of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 in SLE patients and HC;B.The ROC curve analysis of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 in SLE patients and RA patients;C.The ROC curve analysis of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0082626 in SLE patients and HC;D.The ROC curve analysis of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0082626 in SLE patients and RA patients.

        圖4 聯合全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626的ROC曲線分析Fig.4 ROC curve analysis of combined peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 and hsa_circ_0082626Note:A.The ROC curve analysis of combined peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 and hsa_circ_0082626 in SLE patients and HC;B.The ROC curve analysis of combined peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 and hsa_circ_0082626 in SLE patients and RA patients.

        2.5聯合全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626對SLE診斷價值 聯合全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626對SLE診斷價值分析發(fā)現,SLE疾病組聯合全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156-hsa_circ_0082626在用于區(qū)別HC和RA疾病對照組的AUC分別為0.757(圖4A)和0.815(圖4B),均高于單項環(huán)狀RNA的AUC。聯合全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156-hsa_circ_0082626診斷SLE疾病組與HC的敏感度和特異度分別為72.34%和71.88%;聯合全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156-hsa_circ_0082626鑒別SLE疾病組與RA疾病對照組的敏感度和特異度分別為72.34%和83.78%。

        3 討論

        環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156位于4號染色體,即4號染色體1902352-1920350(正鏈),被 RNA 轉錄酶 Ⅱ 轉錄,其轉錄本有1439 nt[12]。環(huán)狀RNA hsa_circ_0082626位于7號染色體,即7號染色體138758601-138774505(負鏈),被 RNA 轉錄酶Ⅱ轉錄,其轉錄本有1564 nt[13]。目前尚未見有關環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626的研究報道。本課題組前期采用高通量基因芯片篩查發(fā)現SLE患者全血中環(huán)狀RNA表達譜發(fā)生了一些變化。本研究中,以變化顯著的環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626為研究對象,探討環(huán)狀RNA RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626在SLE全血中的表達水平及其意義。

        結果顯示,相比于RA疾病對照組及正常對照組,SLE疾病組全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626的表達量顯著上調。ROC曲線分析環(huán)狀RNA 的診斷價值發(fā)現,全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626的AUC分別為0.727(敏感度為51.06%,特異度為87.50%)和0.717(敏感度為63.83%,特異度為81.25%),而兩者聯合診斷的AUC更高,可達到0.757(敏感度為72.34%,特異度為71.88%),提示全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626可能作為診斷SLE的潛在有效標識。進一步采用ROC曲線分析環(huán)狀RNA是否能將RA患者中鑒別診斷SLE患者發(fā)現,全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626的AUC分別為0.750(敏感度為72.34%,特異度為70.27%)和0.806(敏感度為72.34%,特異度為83.78%),而兩者聯合診斷的AUC更高,可達到0.815(敏感度為72.34%,特異度為83.78%),提示全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626可能用于SLE與RA的鑒別診斷。

        越來越多的研究證實環(huán)狀RNA不僅可以作為SLE的診斷標志物,而且可用于評估疾病的嚴重程度。比如,Miao等[14]研究結果發(fā)現下調的circPTPN22與SLE的疾病活動性評分呈負相關,且經治療SLE病情緩解后其circPTPN22的表達水平可明顯上調;Li等[15]證實兒童SLE患者全血中的hsa_circ_0021372 和 hsa_circ_0075699與SLE患者的C3/C4疾病活動性指標相關;此外,Ouyang等[16]研究結果表明血漿circRNA_002453不但可以作為狼瘡腎的新型診斷標志物,而且可作為狼瘡腎嚴重程度的評價指標。本文研究也發(fā)現全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表達水平分別與C3和C4呈負相關,還發(fā)現全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表達水平與自身抗體的產生密切相關。進一步分析SLE患者環(huán)狀RNA與SLE臨床表現的關系發(fā)現,hsa_circ_0004156表達水平與SLE患者心包炎、貧血、低白細胞血癥相關,而hsa_circ_0082626表達水平與SLE患者低血小板血癥相關。這些結果證實了SLE患者全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表達水平與疾病的活動度和嚴重程度密切相關,其不僅可能作為SLE診斷及鑒別診斷指標,還可作為評估SLE疾病嚴重程度和活動度的指標。

        需要指出的是,本文還存在一些不足:①SLE患者病例數較少,尤其是并發(fā)心包炎、貧血、低白細胞血癥、低血小板血癥的患者。雖然采用合適的統(tǒng)計學方法得出上述臨床表現與全血環(huán)狀RNAhsa_circ_0004156、hsa_circ_0082626相關,但后續(xù)應該擴大SLE患者樣本量,尤其是并發(fā)上述癥狀的SLE患者,進一步證實SLE患者全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表達水平與這些臨床表現的關系。②由于缺乏對照組的自身抗體、C3、C4等數據,未聯合評價環(huán)狀RNA+自身抗體/C3/C4對SLE的診斷價值。

        綜上,SLE患者全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626明顯升高,且與疾病活動性、自身抗體產生以及臨床癥狀密切相關,可能作為SLE的潛在診斷及鑒別診斷標志物,同時可作為評估疾病嚴重程度和活動性的指標。但hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626如何調控SLE發(fā)病尚不清楚,希望通過更多的研究來探討hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626在SLE中所呈現的致病作用。

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