于衛(wèi)建 邵林楠 戚 凝 王海霞 梁曉華

(大連市血液中心,大連116001)

乳腺癌是女性群體中最主要的癌癥相關(guān)性死亡疾病之一，大概以每年0.5%的增長率增長，病死率僅次于肺癌，在城市女性中發(fā)病率僅次于宮頸癌。我國乳腺癌發(fā)病率逐年增高，現(xiàn)已成為城市人口死亡率增長最快的癌癥，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢，防控形勢極為嚴(yán)峻。

自然殺傷細(xì)胞(natual killer cell,NK cell)是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是抵御癌細(xì)胞和感染的第一道防線。免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptors，KIR)主要表達(dá)在NK細(xì)胞及部分T細(xì)胞表面，屬于免疫球蛋白樣超家族成員，且具有高度多態(tài)性[1]。NK細(xì)胞通過膜上的免疫球蛋白樣受體識別HLA-Ⅰ類分子，傳導(dǎo)抑制性或激活性信號，從而調(diào)節(jié)NK細(xì)胞和部分T細(xì)胞的免疫應(yīng)答[1，2]。已有研究證實NK細(xì)胞具有殺傷腫瘤細(xì)胞的功能。研究發(fā)現(xiàn)，KIR基因和其HLA-C配體基因多態(tài)性與病原體感染、自身免疫性疾病、白血病和腫瘤等疾病具有相關(guān)性[3，4]。但少有關(guān)于KIR和HLA-C配體基因多態(tài)性與乳腺癌相關(guān)性的研究。本研究主要探討中國人群中乳腺癌與KIR和HLA-C配體基因多態(tài)性是否相關(guān)。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1患者信息 以大連市各醫(yī)院2016年4月～7月期間的住院患者血液標(biāo)本106例為實驗組，臨床病理確診為乳腺癌，女性，年齡31～61歲。對照組為在各醫(yī)院健康體檢的健康女性志愿者血液標(biāo)本112例，年齡35～64歲，見表1。本研究經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)和研究對象同意。

1.1.2試劑與儀器 MageCoreHF16型全自動核酸提取儀、DNA提取試劑盒購自臺灣RBC BIOSCIENCE；9700型PCR儀購自美國ABI；LABScanTM200 Luminex儀器購自Luminex Corp；PCR-SSOKIR試劑盒購自美國LIFECODES公司；PCR-SSO HLA-Cw試劑盒購自美國One Lambde。

1.2方法

1.2.1DNA提取 按試劑盒說明書提取DNA，DNA濃度>20 ng/μl，260/280 比值在1.6～1.9之間的標(biāo)本可用于后續(xù)實驗。

1.2.2KIR檢測 按照試劑盒說明書操作，分別擴(kuò)增KIR的4、5、7、8和9號外顯子；共檢測16個KIR基因(2DS1、2DS2、2DS3、2DS4、2DS5、3DS1、2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、2DL5、3DL1、3DL2、3DL3、2DP1、3DP1)；基因擴(kuò)增產(chǎn)物與探針雜交后檢測分型。在2DS4基因中，因第5外顯子存在1個22 bp缺失的亞型，可分為缺失型2DS4(Del)和非缺失型2DS4(ND)。

1.2.3HLA-Cw檢測 按照HLA-Cw試劑盒說明書操作，通過SAPE標(biāo)記PCR產(chǎn)物，變性，并與標(biāo)記熒光微珠的探針雜交，在Luminex儀器上檢測分型。分型結(jié)果依據(jù)其等位基因可分為2組，HLA-C1包括：HLA-C01、03、07(01-06)、08、12(02、03、06)、14、16 (01、03、04)；HLA-C2包括：HLA-C02、04、05、06、0707、12(04、05)、15、1602、17、18。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 KIR、HLA-C等位基因頻率采用直接計數(shù)法計算；采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件比較分析實驗組與正常對照組間KIR等位基因分布頻率差異，并進(jìn)行χ2檢驗，計算χ2值、P值。經(jīng)Bonferroni校正后，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，并計算OR及95%CI。

2 結(jié)果

2.1乳腺癌患者KIR位點等位基因分析 結(jié)果顯示，框架基因2DL1、2DL4、3DL2、3DL3在所有標(biāo)本中均百分百存在；框架基因2DL3和假基因2DP1、3DP1幾乎全部存在(患者99.1% vs對照100%)；在所有標(biāo)本中呈現(xiàn)出KIR抑制基因頻率明顯高于激活基因頻率的趨勢； 除2DS4外，其他激活基因頻率均低于50%。乳腺癌患者中KIR2DS4(ND)基因頻率明顯低于健康對照組(73.6% vs 85.7%，P<0.05，OR=0.488，95%CI：0.246～0.969)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果見表2。

表1 患者基本情況

2.2乳腺癌患者KIR配體HLA-C頻率分析 結(jié)果顯示，KIR配體HLA-C基因頻率在乳腺癌患者與健康志愿者中的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果見表3。

表2 乳腺癌患者與健康對照組 KIR 基因頻率比較

表3 乳腺癌患者與正常對照組 KIR 配體頻率比較

3 討論

KIR基因家族是一組高度同源、緊密連鎖的基因，位于人類染色體19q13.4[5]。截至目前，已發(fā)現(xiàn)包含假基因在內(nèi)的17個KIR基因，依據(jù)其功能分為激活性基因、抑制性基因和假基因。激活性基因包括2DL4、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4、2DS5、3DS1，抑制性基因有2DL1、2DL2、2DL3、2DL5A、2DL5B、3DL1、3DL2、3DL3，假基因有2DP1和3DP1。在KIR基因命名中，2D、3D分別代表KIR分子在膜外的Ig結(jié)構(gòu)域的數(shù)量為2、3；另外依據(jù)KIR分子留在胞漿中尾部的長短，分別標(biāo)記為L或S[6]。

KIR2DS4已檢出12個等位基因，其中只有9個等位基因的特異性出現(xiàn)在編碼區(qū)。在這9個等位基因中，2DS4*003、*004、*006、*007、*008、*009在第5外顯子中存在22 bp的缺失，導(dǎo)致其編碼的KIR分子缺少了跨膜區(qū)和胞漿區(qū)的結(jié)構(gòu)蛋白。只有2DS4*00101、*00102和 *00103等位基因能夠編碼完整的KIR分子[7]。

研究表明靶細(xì)胞表面HLA分子的表達(dá)會影響NK的作用，從而影響對腫瘤細(xì)胞的初期免疫識別[8]。當(dāng)靶細(xì)胞表面表達(dá)HLA-Ⅰ類分子，通過NK細(xì)胞上KIR抑制性受體與HLA分子結(jié)合并釋放抑制信號，阻斷NK細(xì)胞的殺傷活性，保護(hù)靶細(xì)胞不被NK細(xì)胞消滅。當(dāng)靶細(xì)胞表面下調(diào)或丟失HLA-Ⅰ分子，KIR無法與HLA分子結(jié)合，導(dǎo)致KIR激活受體啟動，釋放激活信號，激活NK細(xì)胞的殺傷活性，靶細(xì)胞將被NK細(xì)胞消滅[9]。腫瘤細(xì)胞逃逸理論認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞可通過下調(diào)或丟失HLA-Ⅰ分子避免T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫攻擊，但容易被NK細(xì)胞介導(dǎo)的攻擊溶解。依據(jù)HLA-C分子上第80位(與KIR分子結(jié)合位)是天冬酰氨(Asn)還是賴氨酸(Lys)，HLA-C等位基因可以為兩組，C1(HLA-C Asn80)：HLA-Cw1、Cw3、Cw7、Cw8、Cw13、Cw14；C2(HLA-C Lys80)：HLA-Cw2、Cw4、Cw5、Cw6、Cw17、Cw18。KIR2DL2,2DL3和2DS2結(jié)合C1配體，KIR2DL1和2DS1結(jié)合C2配體，KIR3DL1和KIR3DL1結(jié)合Bw4[10-12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者中KIR2DS4(ND)基因頻率明顯低于健康志愿者(73.6% vs 85.7%，P<0.05，OR=0.488，95%CI：0.246～0.969)，表明KIR2DS4(ND)可能是乳腺癌保護(hù)基因。KIR配體HLA-C基因頻率在乳腺癌患者與健康志愿者中的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。將本次研究結(jié)果與世界其他國家乳腺癌相關(guān)研究對比發(fā)現(xiàn)，結(jié)果并不一致，例如土耳其的乳腺癌患者中KIR2DL1表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)(90.0% vs 100%)、2DS1表現(xiàn)為正相關(guān)(54.5% vs 31.2%)[13]；在巴西人群中，2DL2表現(xiàn)為正相關(guān)(73.9% vs 56.4%)[14]；在沙特阿拉伯人群中，KIR2DS2，2DS3，2DL5A均為正相關(guān)[15]。乳腺癌與KIR配體HLA-C基因多態(tài)性相比，巴西人群中C1和C1C2均為負(fù)相關(guān)；在沙特阿拉伯人群中C1C2正相關(guān)，C2C2為負(fù)相關(guān)[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)框架基因2DL1、2DL4、3DL2、3DL3均百分百存在于所有標(biāo)本中，2DL3和假基因2DP1、3DP1在幾乎所有標(biāo)本中存在(患者99.1% vs對照100%)；本次實驗數(shù)據(jù)顯示KIR抑制基因頻率呈現(xiàn)出明顯高于激活基因的趨勢；除了2DS4外，其他激活基因頻率均低于50%，明顯低于健康對照組。與世界其他國家相關(guān)數(shù)據(jù)對比分析發(fā)現(xiàn)，本次試驗的KIR及其配體HLA-C的基因頻率在正常人群的分布特點與世界其他國家大致趨同。

本次研究初步解釋了KIR及其配體HLA-C與乳腺癌的相關(guān)性，KIR2DS4(ND)可能是乳腺癌保護(hù)基因，配體HLA-C基因與乳腺癌無相關(guān)性。本研究結(jié)果與其他國家不一致的可能原因包括：研究對象的數(shù)量太少、不同的遺傳背景、不同的生活方式及環(huán)境因素等。KIR及其配體HLA-C與乳腺癌相互作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。